屎腸球菌對(duì)大腸桿菌感染肉雞生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)和盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

曹廣添，代 兵，張玲玲，曾新福，楊彩梅*

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，杭州 311300；2. 浙江惠嘉生物科技股份有限公司，安吉 313300)

大腸桿菌病(Colibacillosis)一直是家禽養(yǎng)殖的難題之一，其帶來(lái)腸道疾病的同時(shí)也造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。在家禽生產(chǎn)中，使用抗生素是控制大腸桿菌感染最常用的方法[2]。然而，隨著抗生素在全球范圍內(nèi)逐漸被取締，益生菌作為其替代物已被發(fā)現(xiàn)可以提高畜禽生長(zhǎng)性能[3-4]，增強(qiáng)免疫功能[5-7]和調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系[8]。

屎腸球菌(Enterococcusfaecium，簡(jiǎn)稱E.faecium)，是腸道中常見(jiàn)的產(chǎn)乳酸的菌種，作為益生菌已廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)，美國(guó)飼料控制辦公室已將其列為研究對(duì)象[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌可提高畜禽的生長(zhǎng)性能，改善健康，使用對(duì)象主要包括豬[11]、牛[12]、肉雞[13-15]甚至魚類[16-17]等。M.Levkut等[18]發(fā)現(xiàn)，飼喂屎腸球菌EF55對(duì)沙門氏菌感染肉雞早期的免疫功能有調(diào)節(jié)作用。然而，很少有試驗(yàn)報(bào)道屎腸球菌的飼喂對(duì)大腸桿菌感染肉雞的影響。

本研究以白羽肉雞為試驗(yàn)動(dòng)物，早期(7日齡)攻毒后，初步研究飼喂屎腸球菌對(duì)其生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)和盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)

本試驗(yàn)于浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地(中國(guó)，杭州)選取1日齡健康狀況良好的白羽肉雞360羽(平均體重(49.4±1.4) g)，隨機(jī)分為4組，每組肉雞(公母各半)6個(gè)重復(fù)(每重復(fù)15只)，單籠飼養(yǎng)。試驗(yàn)期間，肉雞自由采食和飲水。雞舍內(nèi)溫度第一周維持在32 ℃，隨后逐漸減低至25 ℃?；A(chǔ)日糧參考NRC(1994)相關(guān)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)配制(表1)。

試驗(yàn)共持續(xù)4周，第一周結(jié)束后，陽(yáng)性對(duì)照組、屎腸球菌組和抗生素組肉雞用一次性注射器口腔注射1 mL大腸桿菌菌液K88(108cfu·mL-1)。陰、陽(yáng)性對(duì)照組肉雞采食基礎(chǔ)日糧，屎腸球菌組肉雞采食添加109cfu·kg-1屎腸球菌的基礎(chǔ)日糧，抗生素組肉雞采食添加10 mg·kg-1硫酸粘桿菌素的基礎(chǔ)日糧。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal experimental diet (air-dry basis) %

預(yù)混料為每千克飼糧提供：VA 1 500 IU；VD3200 IU；VE 10 IU；VB23.5 mg；泛酸10 mg；煙酸30 mg；鈷胺素10 μg；氯化膽堿1 000 mg；生物素0.15 mg；葉酸0.5 mg；硫胺素1.5 mg；VB63.0 mg；鐵80 mg；鋅40 mg；錳60 mg；碘0.18 mg；銅8 mg；硒0.15 mg
Premix supplied per kilogram of diet: vitamin A (retinyl acetate) 1 500 IU; cholecalciferol 200 IU; vitamin E (DL-α-tocopheryl acetate) 10 IU; riboflavin 3.5 mg; pantothenic acid 10 mg; niacin 30 mg; cobalamin 10 μg; choline chloride 1 000 mg; biotin 0.15 mg; folic acid 0.5 mg; thiamine 1.5 mg; pyridoxine 3.0 mg; Fe 80 mg; Zn 40 mg; Mn 60 mg; I 0.18 mg; Cu 8 mg; Se 0.15 mg

1.2 菌種制備

屎腸球菌(HJEF005，雞腸道分離所得)及大腸桿菌K88制備參照文獻(xiàn)[19]的方法。

1.3 生長(zhǎng)性能測(cè)定

在7、10、14、21和28日齡，肉雞每只進(jìn)行稱重，用于計(jì)算其體重和平均日增重。

1.4 樣品收集

在試驗(yàn)10、14、21和28天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選體重相近的2只健康狀況良好的肉雞，采用靜脈割斷方法進(jìn)行宰殺，促凝管收集血液后離心取血清，用以檢測(cè)血清生化指標(biāo)。解剖并用無(wú)菌繩結(jié)扎盲腸后放入冰盒，其內(nèi)容物在超凈工作臺(tái)內(nèi)用EP管收集放入-80 ℃冰箱保存用以PCR-DGGE檢測(cè)。

1.5 血清生化指標(biāo)測(cè)定

血清中免疫球蛋白IgA、IgE、IgM濃度利用ELISA試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，武漢)檢測(cè)；補(bǔ)體C3、C4和溶菌酶濃度檢測(cè)使用南京建成試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京)；操作步驟均參照說(shuō)明書。

1.6 PCR-DGGE檢測(cè)

肉雞盲腸微生物菌群(16S rRNA的V3區(qū))結(jié)構(gòu)和多樣性用PCR-DGGE檢測(cè)。為減小樣本的多樣性，試驗(yàn)將每組中12個(gè)盲腸樣品每4只合并為一個(gè)生物樣本進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。微生物DNA提取采用Mobio試劑盒(Mo Bio, Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA)，具體提取步驟參閱美國(guó)Mobio網(wǎng)站。PCR引物采用GC-338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和534R (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)。試驗(yàn)采用50 μL反應(yīng)體系：混合物包括10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1) 4 μL，引物338F(20 μmol·L-1) 1 μL，引物534R(20 μmol·L-1) 1 μL，模板DNA 2.5 ng，TaKaRa rTaq(5 U·μL-1) 0.25 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：初始溫度94℃10 min，30個(gè)循環(huán)(94 ℃ 60 s, 55 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%凝膠瓊脂進(jìn)行鑒定。

DGGE分析中聚丙烯酰胺凝膠的濃度為8%，變性劑梯度為30%～60%(100%變性劑包括7 mol·L-1尿素和40%(v/v)離子甲酰胺)，電泳條件為140 V 450 min。染色采用銀染方法，用UMAX Power Look 1000透射掃描儀(Techville, Inc., Dallas, USA)掃描獲得的DGGE圖譜圖片。最終，利用BioEdit7.0 (Bio-Rad Canada, Mississauga, ON, Canada)、Phylip4.0及MEGA3.1軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 16.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果各處理進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，同時(shí)采用Duncan多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，以P<0.05為判斷差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 屎腸球菌對(duì)感染大腸桿菌肉雞生長(zhǎng)性能的影響

表2數(shù)據(jù)顯示，飼喂屎腸球菌改變了肉雞的生長(zhǎng)性能。21、28日齡陰性對(duì)照組肉雞體重顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)；14、21、28日齡屎腸球菌組肉雞體重顯著高于陰性和陽(yáng)性對(duì)照組肉雞(P<0.05)；另外，大腸桿菌攻毒顯著降低了陽(yáng)性對(duì)照組10～14、15～21 和22～28日齡肉雞的平均日增重(P<0.05)。另外，飼喂屎腸球菌顯著提高了攻毒肉雞10～28日齡的平均日增重(P<0.05)。

2.2 屎腸球菌對(duì)大腸桿菌感染肉雞血清免疫蛋白的影響

表3顯示了肉雞血清中免疫球蛋白的變化，10、21和28日齡陽(yáng)性對(duì)照肉雞血清中IgA的濃度顯著高于陰性對(duì)照組肉雞(P<0.05)。在14和21日齡，與陰性和陽(yáng)性對(duì)照肉雞相比，采食添加屎腸球菌和抗生素日糧顯著提高了肉雞血清中IgA的濃度(P<0.05)。整個(gè)試驗(yàn)中，與陰性對(duì)照肉雞相比，屎腸球菌組和抗生素組顯著增加了肉雞血清中IgG的濃度(P<0.05)。與14和21日齡陽(yáng)性對(duì)照肉雞相比，飼喂屎腸球菌顯著增加了血清中IgG的濃度(P<0.05)；與10和28日齡陰性對(duì)照肉雞相比，陽(yáng)性對(duì)照組和屎腸球菌組肉雞血清中IgM濃度顯著增加(P<0.05)，而后兩者間無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果說(shuō)明，飼喂屎腸球菌可以顯著提高肉雞血清中免疫球蛋白的濃度。

2.3 屎腸球菌對(duì)大腸桿菌感染肉雞血清補(bǔ)體濃度的影響

表4顯示，在21日齡時(shí)，E. f組肉雞血清中補(bǔ)體C3的濃度顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(0.263 mg·mL-1vs. 0.209 mg·mL-1,P=0.033)；另外，28日齡E. f組肉雞血清中補(bǔ)體C4的濃度顯著高于陰性對(duì)照和抗生素組(0.162 mg·mL-1vs. 0.122、0.118 mg·mL-1，P=0.01)。而且，飼喂屎腸球菌的肉雞較21和28日齡抗生素組，血清中C4濃度有了顯著提高(0.093 mg·mL-1vs. 0.069 mg·mL-1,P=0.019;0.162 mg·mL-1vs. 0.118 mg·mL-1,P=0.010)。以上結(jié)果表明，肉雞采食添加屎腸球菌日糧可以顯著提高大腸桿菌攻毒肉雞血清中補(bǔ)體的濃度。

表2 屎腸球菌對(duì)肉雞體重和平均日增重的影響Table 2 Effects of Enterococcus faecium on body weight and average daily gain in broilers

同行數(shù)據(jù)后所標(biāo)字母相異表示差異顯著(P<0.05)，所標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下表同
Different letters in the same row means significant difference between treatments (P<0.05), the same letter in the same row means no significant difference between treatments (P>0.05). The same as below

表3 屎腸球菌對(duì)肉雞血清中免疫球蛋白的影響Table 3 Effects of Enterococcus faecium on the levels of serum immunoglobulins in broilers μg·mL-1

10到21日齡，陽(yáng)性對(duì)照、抗生素組及屎腸球菌組肉雞與陰性對(duì)照組相比，血清中溶菌酶的濃度均有顯著增加(1.429、1.684、1.673 ng·mL-1vs. 1.216 ng·mL-1; 1.573、2.164、2.029 ng·mL-1vs. 1.269 ng·mL-1; 2.059、2.012、1.997 ng·mL-1vs. 1.548 ng·mL-1;P=0.001)。而且，10～14日齡抗生素和屎腸球菌組肉雞較陽(yáng)性對(duì)照組肉雞，血清中溶菌酶濃度顯著增加(1.684、1.673 ng·mL-1vs. 1.429 ng·mL-1; 2.164、2.029 ng·mL-1vs. 1.573 ng·mL-1;P=0.001)。另外，試驗(yàn)期間抗生素和屎腸球菌組肉雞血清中溶菌酶的濃度均沒(méi)有顯著不同。試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂添加屎腸球菌的日糧可以顯著增加肉雞血清中溶菌酶的濃度。

表4 屎腸球菌對(duì)攻毒肉雞血清中補(bǔ)體和溶菌酶的影響Table 4 Effects of Enterococcus faecium on serum complement components and lysozyme in broilers

2.4 屎腸球菌對(duì)大腸桿菌感染肉雞盲腸微生物菌群的影響

表5和圖1顯示，28日齡攻毒肉雞盲腸微生物的多樣性指數(shù)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，飼喂屎腸球菌顯著增加28日齡肉雞盲腸微生物菌群的香農(nóng)指數(shù)。聚類分析顯示，屎腸球菌組肉雞盲腸微生物菌群穩(wěn)定分布(圖2)。與陰性對(duì)照組相比，屎腸球菌組肉雞盲腸菌群有顯著變化。

表5 肉雞盲腸微生物菌群PCR-DGGE多樣性指數(shù)Table 5 Diversity index of cecal microflora community based on the PCR-DGGE DNA fingerprinting

NC、PC、Anti和E.f分別代表陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、抗生素組和屎腸球菌組；NC 1、2、3分別代表陰性對(duì)照組3個(gè)肉雞盲腸生物樣本，PC、Anti和E.f同NC。下同NC represents negative control birds, PC represents positive control birds, E. f represents E. faecium-fed birds, Anti represents antibiotic-fed birds; NC 1, 2, 3 represent the cecal samples of birds in negative control group, which is same with PC, Anti and E.f. The same as below圖1 肉雞盲腸微生物16S rRNA V3區(qū)的PCR-DGGE圖Fig.1 PCR-DGGE DNA fingerprinting of the V3 region of 16S rRNA of cecal microbiota of broilers

AN、NC、PC、EF分別代表抗生素組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和屎腸球菌組AN,NC,PC,EF represent the antibiotic-fed birds,negative control,positive control and E.faecium-fed birds groups,respectively圖2 肉雞盲腸微生物樣本PCR-DGGE聚類圖Fig. 2 Cluster analysis based on DGGE profiles from broiler cecal samples

3 討 論

3.1 飼喂屎腸球菌對(duì)大腸桿菌感染肉雞生長(zhǎng)性能的影響

近年來(lái)，抗生素在家畜養(yǎng)殖方面的應(yīng)用逐漸被取締，而其替代品則引起了研究者的興趣。我們都知道，大腸桿菌是禽類生長(zhǎng)的慢性應(yīng)激源[20]，且第一周往往是大腸桿菌感染的最脆弱時(shí)期[21]。本研究結(jié)果表明，與陰性對(duì)照相比，陽(yáng)性對(duì)照組肉雞的體重和平均日增重顯著減少。M.E.Cook[22]發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物攻毒會(huì)減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)而影響生長(zhǎng)性能，主要表現(xiàn)在防御過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收減少。K.Takahashi等[23]報(bào)道稱，注射免疫炎性因子(如LPS)不僅降低動(dòng)物的免疫反應(yīng)，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)的減慢。屎腸球菌已作為益生菌用以治療動(dòng)物和人類腸炎疾病很長(zhǎng)時(shí)間[24]。當(dāng)前試驗(yàn)顯示，飼喂屎腸球菌可以顯著提高大腸桿菌攻毒后肉雞的體重和平均日增重。A.B.M.R.Bostami等[25]研究顯示，肉雞采食添加含有屎腸球菌的益生菌，平均日增重和日采食量有顯著提高，且料重比顯著減低。K.C.Mountzouris等[4]認(rèn)為，屎腸球菌顯著提高肉雞生長(zhǎng)性能的作用機(jī)理是其對(duì)腸道形態(tài)的有益作用。此前的研究結(jié)果顯示，屎腸球菌對(duì)大腸桿菌感染的肉雞腸道形態(tài)的發(fā)育很有益，尤其是對(duì)絨毛高度和隱窩深度[19]。但P.A.Barrow[26]推測(cè)，腸道微生物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的互作也有可能是其促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的主要原因。A.Zheng等[27]則對(duì)采食了屎腸球菌肉雞的肝蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了分析，認(rèn)為其很有可能通過(guò)改變?nèi)怆u的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分配來(lái)促進(jìn)機(jī)體的最佳養(yǎng)分利用。

3.2 屎腸球菌對(duì)大腸桿菌感染肉雞血清生化指標(biāo)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，益生菌也可增加腸黏膜抗炎和促炎因子的濃度[13]。I.Ahmad[28]證實(shí)，益生菌可能通過(guò)增加抗體IgM和IgG的產(chǎn)生來(lái)提高機(jī)體的免疫功能。此前的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼喂屎腸球菌可以顯著提高早期肉雞回腸黏膜IL-4、TNF-α 和 S-IgA的濃度[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與陽(yáng)性和陰性對(duì)照組肉雞相比，屎腸球菌組肉雞顯著增加了血清中IgA濃度(14～28日齡)；另一方面，21日齡屎腸球菌組肉雞血清中C3濃度顯著高于陽(yáng)性對(duì)照，28日齡C4濃度顯著高于陰性對(duì)照。以上結(jié)果表明，大腸桿菌K88或屎腸球菌促進(jìn)了血清中IgA和IgG的分泌，與R.R.Kulkarni等[29]的研究結(jié)果相似。大量試驗(yàn)結(jié)果也表明，益生菌可以促進(jìn)肉雞機(jī)體的免疫反應(yīng)[7,14, 30]。但K.C.Mountzouris等[6]發(fā)現(xiàn)，多種益生菌(包括腸球菌)的飼喂對(duì)肉雞血漿中免疫球蛋白的濃度沒(méi)有顯著作用。M.Levkut 等[18]試驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌EF 55對(duì)沙門氏菌攻毒肉雞的外周血中淋巴細(xì)胞亞群(CD4、CD8、CD4和IgM)數(shù)量沒(méi)有明顯的影響。還需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步探究屎腸球菌如何增加感染大腸桿菌肉雞血清中免疫蛋白的濃度。

3.3 屎腸球菌對(duì)大腸桿菌感染肉雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，攻毒肉雞采食添加屎腸球菌日糧后，盲腸微生物的種類有顯著增加。J.W.Park等[31]發(fā)現(xiàn)，蛋雞飼喂屎腸球菌后，糞便中大腸桿菌的數(shù)量有顯著的減少；糞便中菌群的改變伴隨著體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收能力的提高和糞便中氨氣含量的降低。但M.M.Gheisar等[32]試驗(yàn)結(jié)果卻顯示，采食添加屎腸球菌日糧的肉雞糞便中大腸桿菌和乳酸菌的數(shù)量沒(méi)有發(fā)生顯著變化。此前的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌增加了肉雞盲腸中有益微生物乳酸菌和雙氣桿菌的數(shù)量，減少了大腸桿菌的數(shù)量，與其他試驗(yàn)結(jié)果類似[10,19,33]。綜上所述，屎腸球菌是通過(guò)增加肉雞腸道中有益菌的種類，減少有害菌的數(shù)量來(lái)調(diào)節(jié)微生物菌群的種類和多樣性。

4 結(jié) 論

日糧中添加屎腸球菌提高了大腸桿菌感染肉雞的生長(zhǎng)性能，提高了免疫相關(guān)指數(shù)，改善了盲腸內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的多樣性；肉雞飼喂屎腸球菌相較于抗生素組，整個(gè)試驗(yàn)周期平均日增重顯著增加，試驗(yàn)?zāi)┭逯蠭gA濃度有顯著提高，盲腸中菌群的多樣性和豐度均有顯著增加。

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