加米霉素注射液特殊安全性試驗(yàn)研究

張?jiān)栖纾?菲，路美玉

(華北制藥集團(tuán)動(dòng)物保健品有限責(zé)任公司，石家莊050041)

加米霉素注射液屬動(dòng)物專用大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗生素，已上市產(chǎn)品為法國(guó)梅里亞公司的Zactran。主要作用于溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌等引起牛呼吸道疾病的病原菌[1]。此外，對(duì)牛傳染性胸膜肺炎的病原體-絲狀支原體絲狀亞種[2]、馬鏈球菌獸疫亞種和對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥和敏感的馬紅球菌[3]以及豬肺炎支原體和胸膜肺炎放線桿菌[4]均具有較好的體外抗菌活性。由于加米霉素在靶組織中有較高的活性濃度，對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病病原菌藥效迅速且持久[5]，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、動(dòng)物專用、單次給藥、吸收迅速、生物利用度高、低殘留、安全高效等優(yōu)點(diǎn)，故在動(dòng)物呼吸道感染性疾病防治中具有廣闊的應(yīng)用前景[6-8]。我國(guó)已批準(zhǔn)進(jìn)口該藥[9]，根據(jù)農(nóng)業(yè)部公告要求，在國(guó)內(nèi)生產(chǎn)此產(chǎn)品，須進(jìn)行特殊安全性試驗(yàn)[10]。鑒于國(guó)內(nèi)當(dāng)前沒有加米霉素注射液臨床使用有關(guān)全部特殊安全性方面的資料，本研究旨在通過豚鼠、大白兔的皮膚致敏、皮膚刺激、局部刺激、紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)，全面考察加米霉素注射液的特殊安全性，從而為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 受試藥物 加米霉素注射液，150 mg/mL，由華北制藥集團(tuán)動(dòng)物保健品有限責(zé)任公司提供，批號(hào)：GMM03-1-GMM1。陽(yáng)性對(duì)照藥物：2，4-二硝基氯苯(含量99%)，購(gòu)自sigma 公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔(體重2.5～3 kg)34只，雌雄各半，單籠、常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，由北京市海淀興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為：NO.1180 5800001198；豚鼠系Hartley種白化豚鼠40只(一級(jí)，體重260～320 g)，雌雄各半，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，由北京市海淀興旺動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0003。

1.3 試驗(yàn)方法及判定原則

1.3.1 皮膚刺激試驗(yàn) 采用新西蘭大白兔進(jìn)行，分組及劑量見表1。取加米霉素注射劑，直接涂布于左側(cè)已去毛的皮膚上，然后用二層紗布(2.5 cm×2.5 cm)和一層無刺激塑料膜覆蓋，再用無刺激膠布固定，家兔的右側(cè)去毛皮膚涂布賦形劑(生理鹽水)作對(duì)照。貼敷4 h后，除去受試物并用溫水清潔給藥部位。每天一次，連續(xù)7 d，每次給藥時(shí)間相同。

每次去除藥物后1 h以及再次貼敷前觀察去毛部位皮膚是否有紅斑、水腫及其他異常表現(xiàn)，并在末次給藥后1、24、48、72 h肉眼觀察去毛部位皮膚局部反應(yīng)，按照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[11](以下簡(jiǎn)稱《原則》)進(jìn)行刺激反應(yīng)評(píng)分。以受試動(dòng)物評(píng)分積分的平均值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),最高積分均值﹤0.50，無刺激性；0.50～2.99，輕度刺激性；3.00～5.99中度刺激性；6.00～8.00強(qiáng)刺激性。

表1 皮膚刺激試驗(yàn)分組、劑量Tab 1 Test group and dose of skin irrigation response

1.3.2 皮膚致敏試驗(yàn) 采用白化豚鼠進(jìn)行，分組及劑量見表2，以豚鼠背部左側(cè)皮膚進(jìn)行染毒。先進(jìn)行誘導(dǎo)接觸，分別在試驗(yàn)0、7、14 d時(shí)，在試驗(yàn)組豚鼠左側(cè)備皮處涂敷加米霉素注射液，在陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物相同部位涂敷2，4-二硝基氯苯。末次誘導(dǎo)后14 d進(jìn)行激發(fā)接觸，實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組涂敷加米霉素注射劑，陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物涂敷2，4-二硝基氯苯。

激發(fā)接觸實(shí)驗(yàn)染毒后24、48、72 h，根據(jù)《原則》評(píng)判是否出現(xiàn)皮膚致敏反應(yīng)并判定致敏強(qiáng)度。

表2 皮膚致敏試驗(yàn)分組、劑量Tab 2 Test group and dose of skin sensitization response

1.3.3 肌肉刺激試驗(yàn) 采用新西蘭大白兔進(jìn)行，分組及劑量見表3。試驗(yàn)前24 h剪去兩側(cè)股四頭肌部位的兔毛，碘酊和乙醇消毒后分別在右側(cè)股四頭肌注入受試藥物，左側(cè)股四頭肌注入同樣體積的滅菌0.9%氯化鈉溶液作對(duì)照。

給予受試物后4、12、24、48 h觀察皮膚表面的反應(yīng)及變化情況。觀察48 h后將家兔處死，剖開股四頭肌，肉眼觀察注射部位肌肉組織的藥液吸收情況，檢查注射局部是否產(chǎn)生刺激性反應(yīng)；并將高、中、低劑量組和對(duì)照組各4只(雌雄各兩只)注射部位肌肉進(jìn)行病理學(xué)檢驗(yàn)。根據(jù)《原則》進(jìn)行刺激反應(yīng)評(píng)分。

表3 肌肉刺激試驗(yàn)分組、劑量Tab 3 Test group and dose of muscle irritation response

1.3.4 溶血試驗(yàn) 試驗(yàn)動(dòng)物為新西蘭大白兔2只，采用體外試管法，即肉眼觀察法進(jìn)行，分組及劑量見表4。采心臟血50 mL，制成脫纖血液，處理后置 37±0.5 ℃的恒溫箱中進(jìn)行溫育。15 min、1 h、2 h、3 h各觀察1次，若試驗(yàn)中的溶液呈澄明紅色，管底無細(xì)胞殘留或有少量紅細(xì)胞殘留，表明有溶血發(fā)生；如紅細(xì)胞全部下沉，上清液體無色澄明，表明無溶血發(fā)生。若溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振搖后不分散，表明有紅細(xì)胞凝聚發(fā)生。如有紅細(xì)胞凝聚的現(xiàn)象，進(jìn)一步判定是真凝聚還是假凝聚。

2 結(jié)果及分析

2.1 皮膚刺激試驗(yàn) 8只受試新西蘭大白兔連續(xù)給藥7 d期間，在其去毛部位均未觀察到皮膚紅斑、水腫及其他異常表現(xiàn)，且在停藥后觀察期限內(nèi)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未出現(xiàn)紅斑和水腫等刺激反應(yīng)，見圖1；根據(jù)《原則》判定受試物加米霉素注射液各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的刺激反應(yīng)積分均值為0，與陰性對(duì)照組比較無顯著差異, 詳見表5，表明受試物加米霉素注射劑對(duì)新西蘭大白兔無皮膚刺激性。

2.2 皮膚致敏試驗(yàn) 受試藥物組和陰性對(duì)照組豚鼠的皮膚在激發(fā)給藥24、48、72 h后，皮膚均未見紅斑和水腫現(xiàn)象(圖2)；根據(jù)《原則》判定受試藥物組和陰性對(duì)照過敏反應(yīng)率為0，而陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠均出現(xiàn)嚴(yán)重或中度紅斑和水腫，過敏反應(yīng)發(fā)生率為100%，詳見表6。表明受試藥物加米霉素注射劑對(duì)豚鼠皮膚進(jìn)行誘導(dǎo)后不出現(xiàn)過敏反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.3 肌肉刺激試驗(yàn) 給予受試物后4、12、24、48 h均未觀察到注射部位充血、瘙癢、起包。給予受試物后48 h處死各劑量組和對(duì)照組各4只(雌雄各兩只)家兔，病理顯示其組織注射部位血管未見出血、血栓、血管擴(kuò)張充血、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)及血管壁周圍組織壞死等異常改變,詳見圖3。判定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的刺激反應(yīng)積分均值為0，與陰性對(duì)照組比較無顯著差異，詳見表7，由此表明受試物加米霉素注射劑對(duì)新西蘭大白兔無皮膚刺激性。

表5 皮膚刺激分值Tab 5 Skin irritation score

賦形劑對(duì)照組(給藥1 d) 受試藥物組(給藥1 d)Excipient Control group (medicated 1 d) Tested medicine group(medicated 1 d)

賦形劑對(duì)照組(停藥后72h) 受試藥物組(停藥后72h)Excipient Control group (withdrawal after72 h) Tested medicine group(withdrawal after72 h)

受試藥物組 陰性對(duì)照組 陽(yáng)性對(duì)照組圖2 豚鼠給藥后72 h皮膚致敏結(jié)果Fig 2 Results of guinea pigs skin sensitization after administration 72 h

時(shí)間(Time)/h分組(Gruop)皮膚紅斑分值(Skin erythema scores)皮膚水腫分值(Skin edema scores)012340123過敏率(Allergy rate)/%24 陽(yáng)性(Positive)004600037100陰性(Negative)100000100000試驗(yàn)(Test)20000020000048 陽(yáng)性(Positive)007300046100陰性(Negative)100000100000試驗(yàn)(Test)20000020000072 陽(yáng)性(Positive)007210046100陰性(Negative)200000200000試驗(yàn)(Test)100000100000

對(duì)照組(給藥前) 高劑量組(給藥前)

對(duì)照組(給藥后48 h) 高劑量組(給藥后48 h)

對(duì)照組(剖檢) 高劑量組(剖檢)

對(duì)照組 高劑量組

劑量(Dose)動(dòng)物編號(hào)(Animal No.)對(duì)照(Control)試驗(yàn)(Test)高(High dose)100200300400500600700800中(Medium dose)9001000110012001300140015001600低(Low dose)17001800190020002100220023002400

2.4 溶血試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果顯示1～6號(hào)試管在3 h內(nèi)紅細(xì)胞全部下沉，上清液體均為澄明，溶液中未見有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀；7號(hào)試管有棕紅色絮狀沉淀，振搖后不分散，詳見圖4，將凝聚物滴加2滴 0.9%氯化鈉溶液，置顯微鏡下觀察，凝聚物不被沖散?？膳卸ㄊ茉囁幬锛瓣幮詫?duì)照未發(fā)生溶血和凝聚，陽(yáng)性對(duì)照組發(fā)生溶血，表明加米霉素注射劑對(duì)兔紅細(xì)胞無溶血和凝聚作用，可以注射使用。

3 結(jié) 論

藥物特殊安全性試驗(yàn)是注射劑臨床前安全性評(píng)價(jià)的重要組成部分，主要由體外溶血性試驗(yàn)、過敏性試驗(yàn)、局部刺激性試驗(yàn)等組成。任何一項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性，則表明該藥安全性評(píng)價(jià)不符合標(biāo)準(zhǔn)，不宜用于注射途徑給藥。國(guó)外對(duì)于加米霉素注射液特殊安全性的公開文獻(xiàn)較少。但ZACTRAN在歐洲獸用藥品委員會(huì)提交注冊(cè)的評(píng)估報(bào)告[12-14]顯示，在3只兔子的皮膚刺激性試驗(yàn)中，加米霉素會(huì)對(duì)皮膚造成輕微刺激，與本試驗(yàn)結(jié)果有差異。分析原因?yàn)樵囼?yàn)用注射液在制備過程中采用了包膜緩釋技術(shù)，改變藥物釋放過程，降低皮膚刺激度。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在藥物的Ⅱ、Ⅲ期靶動(dòng)物臨床試驗(yàn)中得到驗(yàn)證，在牛、豬注射部位均未出現(xiàn)水腫等刺激反應(yīng)。歐盟[12-14]及FDA[15-16]根據(jù)靶動(dòng)物牛、豬的安全性試驗(yàn)判定，加米霉素注射液以6 mg/kg體重劑量注射安全可行。

溫育15 min 溫育3 h圖4 新西蘭大白兔紅細(xì)胞溶血性結(jié)果Fig 4 Result of New Zealand white rabbits red blood cell hemolysis

本研究通過大白兔、豚鼠的皮膚致敏、皮膚刺激、局部刺激、紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)表明，加米霉素注射劑無皮膚刺激性、不出現(xiàn)過敏反應(yīng) (致敏率為0)、無肌肉刺激性、無溶血和凝聚作用，臨床上可以肌肉注射使用。

大環(huán)內(nèi)酯類藥物廣泛應(yīng)用于人及動(dòng)物臨床，如泰拉霉素[17-18]、紅霉素、阿奇霉素和替米考星等，具有優(yōu)良的抗菌抗炎作用[19-20]。加米霉素注射液作為新一代動(dòng)物專用藥品，它的特殊安全性研究及使用推廣在保障食品安全、降低人用抗生素耐藥性上有重要意義。加米霉素注射液屬化學(xué)藥品二類新獸藥，特殊安全性試驗(yàn)為新藥注冊(cè)的重要組成部分，2017年2月原研單位梅里亞有限公司已在我國(guó)進(jìn)口注冊(cè)該品種，本試驗(yàn)的研究對(duì)于搶占國(guó)內(nèi)市場(chǎng)具有重要支持作用。

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