小反芻獸疫活疫苗二次免疫效果評(píng)價(jià)

魯立柱，柏 慶，任國(guó)堂，汪 萍，王 延，黃 炯

(1.天康生物股份有限公司，烏魯木齊 830000；2. 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所 新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，烏魯木齊 830000)

小反芻獸疫(peste des petits ruminants, PPR)又稱“羊瘟”，是由小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)引起羊的高度接觸性傳染病。PPRV可導(dǎo)致高達(dá)100%的發(fā)病率和90%的死亡率。山羊通常對(duì)PPRV的敏感性比綿羊高且康復(fù)率高于綿羊[1-3]。該病是OIE法定報(bào)告動(dòng)物疫病，也是全球計(jì)劃根除的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病[4-5]。PPR活疫苗被用于預(yù)防該病，鑒于該疫苗可產(chǎn)生長(zhǎng)達(dá)3年的免疫持續(xù)期以及我國(guó)成功消滅牛瘟的經(jīng)驗(yàn)，農(nóng)業(yè)部印發(fā)了《全國(guó)小反芻獸疫消滅計(jì)劃(2016—2020年)》[6-7]。

為切實(shí)做好PPR消滅工作，有效保障養(yǎng)羊業(yè)穩(wěn)定健康發(fā)展，按照《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》和《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)》的要求，免疫地區(qū)的養(yǎng)羊場(chǎng)(戶)應(yīng)做好羊群免疫工作，對(duì)新生羔羊和新補(bǔ)欄的羊要及時(shí)補(bǔ)免，并做好免疫記錄，免疫抗體合格率應(yīng)達(dá)到70%以上。但在基層免疫工作中，對(duì)一些免疫背景不清、新補(bǔ)欄羊進(jìn)行補(bǔ)免時(shí)，二次免疫是否會(huì)中和動(dòng)物已經(jīng)產(chǎn)生的PPR抗體從而影響免疫效果，以及對(duì)初次免疫PPR活疫苗后不產(chǎn)生抗體的羊進(jìn)行二次免疫能否產(chǎn)生PPR抗體存在疑問(wèn)，鑒于此開(kāi)展了PPR活疫苗的二次免疫試驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 供試疫苗 PPR活疫苗2016011-1批，由天康生物股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 主要試劑 PPR標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、PPR標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、PPRV Nigeria 75/1株及Vero細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物篩選 試驗(yàn)用綿羊由昌吉興農(nóng)勝商貿(mào)有限公司提供。采集1歲齡左右健康綿羊血100份，用病毒中和試驗(yàn)方法[8]檢測(cè)PPR中和抗體，選擇PPR中和抗體效價(jià)小于1∶4 的綿羊80只用于試驗(yàn)。

1.4 試驗(yàn)分組及免疫接種 一次免疫組，綿羊30只，各頸部皮下注射PPR活疫苗1頭份，監(jiān)測(cè)免疫后21～323 d PPR抗體水平；二次免疫組，綿羊50只，各頸部皮下注射PPR活疫苗1頭份。免疫后21 d，在另一側(cè)頸部皮下注射PPR活疫苗1頭份，監(jiān)測(cè)二免后3～21 d PPR抗體水平。

1.5 免疫抗體檢測(cè) 將被檢羊血清及對(duì)照血清56 ℃水浴滅活30 min。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板將血清進(jìn)行2倍系列稀釋，向所有血清孔中加入含100 TCID50/0.1mL的PPRV，37 ℃作用1 h后向所有孔中加入濃度為2×105/mL～3×105/mL的Vero細(xì)胞懸液0.1 mL。設(shè)立病毒回歸對(duì)照，即將100 TCID50/0.1mL病毒工作液用無(wú)血清MEM細(xì)胞培養(yǎng)液10倍系列稀釋成10 TCID50/0.1mL、1 TCID50/0.1mL、0.1 TCID50/0.1mL，取病毒工作液和3個(gè)稀釋度病毒液，每個(gè)病毒液接種5孔，每孔0.1 mL。置37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)6 d，期間每日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)。

1.6 中和抗體結(jié)果判定 100 TCID50、10 TCID50病毒對(duì)照及陰性血清對(duì)照孔均應(yīng)出現(xiàn)CPE，1 TCID50病毒對(duì)照部分孔出現(xiàn)CPE，0.1 TCID50病毒對(duì)照及陽(yáng)性血清對(duì)照1∶160稀釋度以下細(xì)胞孔和細(xì)胞對(duì)照孔應(yīng)不出現(xiàn)CPE。記錄被檢血清各稀釋度CPE孔數(shù)，以5個(gè)試驗(yàn)孔均未出現(xiàn)CPE的血清最高稀釋度為中和抗體滴度，中和抗體滴度不小于1∶10判為陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1 PPR活疫苗一次及二次免疫效果 PPR活疫苗一次免疫后21 d PPR中和抗體滴度平均可達(dá)5.18±2.87，陽(yáng)性率為84%，一免后180～323 d 每個(gè)月進(jìn)行一次PPR抗體檢測(cè)，PPR抗體陽(yáng)性率均為83%。二次免疫后3～21 d，抗體一直呈上升趨勢(shì)，平均滴度分別為5.65±2.56、6.95±1.82、7.28±1.18、8.12±1.31，陽(yáng)性率分別為90%、100%、100%、100%(表1)。

表1 二次免疫組PPR抗體檢測(cè)結(jié)果Tab 1 PPR antibody detection results of secondary immunization group

2.2 PPR活疫苗持續(xù)期檢測(cè)結(jié)果 PPR活疫苗免疫持續(xù)期可以達(dá)到3年，通過(guò)本次10個(gè)多月的檢測(cè)，免疫后323 d PPR抗體滴度仍然維持在6.59±1.24(圖1)，陽(yáng)性率為83%。

圖1 一次免疫組PPR抗體水平消長(zhǎng)曲線圖Fig 1 Dynamic curves of PPR antibody levels in primary immunization group

3 討 論

PPR活疫苗是一種通過(guò)Vero細(xì)胞培養(yǎng)的弱毒活疫苗，基于對(duì)原宿主失去致病力或致病力弱但仍具有免疫保護(hù)性的Nigeria 75/1株制成。PPR活疫苗自2007年10月開(kāi)始在我國(guó)應(yīng)用，宋躍君、何利昆等人分別對(duì)PPR活疫苗的免疫效果進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)疫苗在免疫場(chǎng)中應(yīng)用半年后PPR抗體陽(yáng)性率可達(dá)83.2%，一年后達(dá)90.3%[9-10]。雖然免疫抗體合格率達(dá)到了70%以上的要求，但由于羊個(gè)體敏感性差異及防疫人員免疫操作水平、疫苗保存條件等因素仍造成了部分羊未達(dá)到免疫保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)。在疫病爆發(fā)時(shí)仍會(huì)造成養(yǎng)殖戶的損失。通過(guò)對(duì)PPR活疫苗的二次免疫試驗(yàn)證實(shí)，一次免疫后21 d抗體陰性率為16%，二次免疫7 d后抗體陽(yáng)性率為100%，說(shuō)明在一次免疫中沒(méi)有產(chǎn)生抗體的羊經(jīng)二次免疫抗體合格率能達(dá)到100%，且對(duì)已經(jīng)產(chǎn)生的PPR抗體不會(huì)產(chǎn)生中和抵消作用。

PPR活疫苗免疫持續(xù)期可以達(dá)到3年，通過(guò)本次10個(gè)多月的檢測(cè)，免疫后323 d PPR抗體滴度仍然維持在6.59±1.24，陽(yáng)性率為83%。另外，不同品種的羊?qū)υ撘呙绲拿庖咝Ч灿胁町悾煅牌嫉葘?duì)免疫PPR活疫苗的湖羊進(jìn)行檢測(cè)表明湖羊在免疫該疫苗后14 d免疫合格率能達(dá)到100%，7個(gè)月后免疫合格率降至88.24%[11]。因此，對(duì)免疫一段時(shí)間后部分羊PPR抗體降低的現(xiàn)象，還是推薦進(jìn)行二次免疫。由于條件限制未對(duì)二次免疫羊群進(jìn)行免疫持續(xù)期監(jiān)測(cè)，但從抗體水平及陽(yáng)性率考慮，其持續(xù)期應(yīng)不低于一次免疫羊群。

疫苗在基層的應(yīng)用中，可能遇到免疫背景不清的羊群，在不具備檢測(cè)條件的情況下是否需要進(jìn)行羊群免疫是基層工作者的疑慮。通過(guò)二次免疫試驗(yàn)證實(shí)，對(duì)已經(jīng)有PPR抗體的羊進(jìn)行再次免疫，羊群平均抗體水平未出現(xiàn)中和反應(yīng)引起的抗體下降現(xiàn)象，相反，二免后PPR抗體陽(yáng)性率明顯提高至100%。因此，養(yǎng)殖戶可根據(jù)羊群的免疫情況及疫病的爆發(fā)情況，選擇是否進(jìn)行疫苗二次免疫。二次免疫試驗(yàn)結(jié)果可對(duì)PPR疫苗的免疫防控工作提供指導(dǎo)，在疫病爆發(fā)時(shí)對(duì)羊群可集中免疫，同時(shí)對(duì)免疫背景不清的羊群也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行免疫。

參考文獻(xiàn)：

[1] Naveen K, Sunil M , Sudhir K K ,etal. Peste des petits ruminants virus infection of small ruminants: a comprehensive review[J]. Viruses, 2014, 6(6): 2287-2327.

[2] Begum S S, Mahato G, Sharma P. Assessment of immune response to a lyophilized peste-des-petits-ruminants virus vaccine in three different breeds of goats[J]. Vet World, 2016, 9(6): 568-571.

[3] Balamurugan V, Hemadri D, Gajendragad M R,etal. Diagnosis and control of peste des petits ruminants: a comprehensive review[J]. Virus Disease, 2014, 25(1): 39-56.

[4] Satya P, Murali M, Eda A,etal. Emergence of PPR and its threat to Europe[J]. Small Rumin Res, 2016, 142: 16-21.

[5] Parida S, Muniraju M, Mahapatra M,etal. Peste des petits ruminants[J]. Vet Microbiol, 2015, 181(1/2): 90-106.

[6] 吳錦艷,尚佑軍,田 宏, 等. 2007-2014年國(guó)內(nèi)外小反芻獸疫流行現(xiàn)狀及分析[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2016, (4): 687-693.

Wu J Y, Shang Y J, Tian H,etal. The epidemic situation and analysis of peste des petits ruminants in China and worldwide from 2007 to 2014[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2016, (4): 687-693.

[7] 劉永宏, 趙 麗, 曹勝波, 等. 小反芻獸疫在中國(guó)的流行趨勢(shì)及應(yīng)對(duì)措施[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2015, 36(1): 110-113.

Liu Y H, Zhao L, Cao S B,etal. Prevelant trends and countermeasures of peste des petits ruminants in China[J]. Progress In Veterinary Medicine, 2015, 36(1): 110-113.

[8] 汪 萍, 尹傳振, 柏 慶, 等. 阻斷ELISA與病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)PPR抗體的比較分析[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2016, 38(8): 658-660.

Wang P, Yin C Z, Bai Q,etal. Comparison of ELISA with the virus neutralization test for detecting serum antibody to peste des petits ruminants[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2016, 38(8): 658-660.

[9] 宋躍君, 徐 玉, 張遠(yuǎn)洲, 等. 小反芻獸疫疫苗臨床免疫效果試驗(yàn)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2016, 37(6)：77-79.

Song Y J, Xu Y, Zhang Y Z,etal. Clinical immune effect of peste des petits ruminants vaccine[J]. Progress In Veterinary Medicine, 2016, 37(6)：77-79.

[10] 何利昆, 段亞良, 谷志大, 等. 遼寧省小反芻獸疫疫苗臨床免疫效果跟蹤試驗(yàn)及抗體水平動(dòng)態(tài)觀察[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2014,(8): 14-18.

He L K, Duan Y L, Gu Z D,etal. Immune efficacy and antibody level of Peste des petits ruminants vaccine in a immuno-logical experiment in Liaoning province[J]. Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2014, (8): 14-18.

[11] 徐婭萍, 邱寒峰, 俞乾挺, 等. 小反芻獸疫疫苗對(duì)不同日齡湖羊的免疫效果研究[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2016, 38(8): 646-648.

Xu, Y P, Qiu H F, Yu H T,etal. The immunization effects on the antibody induced by vaccine of peste des petits ruminants in Hu sheep at different day-old[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2016, 38(8): 646-648.