氟尼辛葡甲胺注射液對靶動物奶牛的安全性研究

孟 芳，鄭 莉，林 紅，馮言言，田振平，孔 梅*，吳連勇*

(1.齊魯動物保健品有限公司，濟(jì)南 250100；2.齊魯晟華制藥有限公司，山東德州251500)

氟尼辛葡甲胺，為非甾體類抗炎藥物(NSAIDs)，美國先靈葆雅公司于20世紀(jì)90年代將其開發(fā)成注射劑并于1998年由FDA[1]批準(zhǔn)用于治療由牛呼吸系統(tǒng)疾病、內(nèi)毒素血癥及急性奶牛乳房炎所導(dǎo)致的發(fā)熱。2007年，農(nóng)業(yè)部第865號公告批準(zhǔn)氟尼辛葡甲胺注射液用于家畜及小動物發(fā)熱性、炎癥性疾患、肌肉痛和軟組織痛。與傳統(tǒng)的NSAIDs相比，氟尼辛葡甲胺化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，解熱鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)，毒副作用低，在牛奶中代謝迅速，休藥期短[2-3]。NSAIDs由于起效迅速，可解熱、減輕炎癥腫脹及疼痛并能改善功能，對控制疾病的進(jìn)程乃至預(yù)后發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，臨床中常與抗生素聯(lián)合使用[4-5]，需求量十分巨大，因此，其在臨床使用中的安全性尤為重要。目前國內(nèi)尚無氟尼辛葡甲胺注射液對靶動物奶牛安全性的相關(guān)研究。本試驗選用健康泌乳奶牛進(jìn)行氟尼辛葡甲胺注射液的靶動物安全性試驗，以期為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品 氟尼辛葡甲胺注射液，規(guī)格100 mL：5 g；批號：1402001，由齊魯動物保健品有限公司提供；推薦用藥方法：靜脈注射：一次量，每1 kg體重，奶牛2.2 mg/kg，連用不超過5 d。

1.2 儀器 全自動血細(xì)胞分析儀(CELL-DYN 400，美國雅培公司)；Technion全自動生化分析儀(RA-1000，美國泰爾康公司)；牛奶體細(xì)胞計數(shù)儀(KD-400，北京康達(dá)智信科技有限公司)。

1.3 動物 從北京市房山區(qū)奶牛場的240多頭荷斯坦奶牛(胎次：2～3胎)中隨機(jī)選擇泌乳期健康奶牛20頭，體重為400～450 kg。

1.4 試驗分組及給藥[6]20頭奶牛隨機(jī)分成4個組，每組5頭。其中3個受試藥物組，即1×(2.2 mg/kg bw)、3×(6.6 mg/kg bw)、5×(11.0 mg/kg bw)推薦劑量組，每日上午8點(diǎn)擠奶后頸靜脈注射給藥1次，連續(xù)給藥7 d，并于最后一次給藥后臨床觀察3 d?？瞻讓φ战M，注射滅菌注射用水。

1.5 觀測指標(biāo)

1.5.1 奶牛臨床表現(xiàn)和乳房局部癥狀 整個試驗期間，觀察記錄用藥奶牛的精神狀態(tài)、采食飲水、糞尿排泄、直腸溫度、呼吸、脈搏、乳房局部癥狀(腫脹、潮紅發(fā)熱、疼痛等)等臨床表現(xiàn)，分別在首次給藥前第0日和首次給藥后第3日和第7日對各組奶牛的上述臨床表現(xiàn)按給定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分(表1～表2)。

表1 奶牛一般臨床表現(xiàn)觀察Tab 1 General Physical Examination of dairy cow

表2 奶牛臨床癥狀和乳房局部癥狀評分表Tab 2 The score of clinical symptom of mammary gland

1.5.2 血液生理指標(biāo) 分別在首次給藥前第0日和首次給藥后第3日和第7日對各組奶牛頸靜脈采血5～10 mL，進(jìn)行血常規(guī)檢查。檢測參數(shù)包括紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、血紅蛋白(HGB)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、血小板計數(shù)(PLT)等。

1.5.3 血液生化指標(biāo) 分別在首次給藥前第0日和首次給藥后第3日和第7日對各組奶牛頸靜脈采血5～10 mL，進(jìn)行血液生化學(xué)檢查。檢測參數(shù)包括膽固醇(CHOL)、血尿素氮(BUN)、葡萄糖(GLU)、肌酐(CREA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)等。

1.5.4 體細(xì)胞數(shù) 在首次給藥前第0日和首次給藥后第3日和第7日對各組奶牛進(jìn)行桶奶采集，采集為每日擠奶三次的中間一次，即上午給藥后的那一次，進(jìn)行桶奶牛奶中體細(xì)胞數(shù)指標(biāo)測定。

1.6 結(jié)果判定、數(shù)據(jù)處理 觀察記錄各劑量組和空白對照組試驗?zāi)膛Ｓ盟幥昂蟮呐R床癥狀，記錄各試驗組奶牛的血液生理指標(biāo)和血清生化指標(biāo)數(shù)值，使用SPSS20.0統(tǒng)計軟件計算各指標(biāo)的平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，采用t檢驗比較各指標(biāo)的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 各劑量組奶牛直腸體溫、脈搏和呼吸次數(shù) 整個試驗期間，給藥組和對照組奶牛直腸體溫、脈搏和呼吸次數(shù)均在正常范圍之內(nèi)。在不同組別的不同時間以及同一組別不同時間點(diǎn)，上述三個指標(biāo)差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 各劑量組奶牛臨床表現(xiàn)和乳房局部癥狀評分

對泌乳期奶牛連續(xù)給藥7 d及停藥后3 d的試驗期間，觀察其精神狀態(tài)、采食飲水、糞尿排泄和乳房局部癥狀(腫脹、潮紅發(fā)熱、疼痛等)，隨著給藥劑量增加、給藥后體內(nèi)作用時間延長，不同組別的不同時間以及同一組別不同時間點(diǎn)，所有動物行為未見異常，未見明顯不良反應(yīng)，也未發(fā)現(xiàn)動物死亡。

2.3 各劑量組奶牛血液生理、血清生化指標(biāo)比較

2.3.1 血液學(xué)指標(biāo)檢查 隨著給藥劑量增加，給藥后體內(nèi)作用時間延長，各試驗組與對照組奶牛在不同時間點(diǎn)以及同一組別不同時間點(diǎn)的血液學(xué)指標(biāo)平均值未出現(xiàn)異常，均在奶牛正常生理指標(biāo)范圍之內(nèi)(表3～表6)，因此，未進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，說明即使5×推薦劑量氟尼辛葡甲胺注射液對奶牛血液指標(biāo)也無顯著影響。

表3 空白對照組給藥后0 d、3 d、7 d時血液學(xué)指標(biāo)值Tab 3 The Hematology of the control group on day 0,3,7 after

紅細(xì)胞數(shù)(RBC)；平均紅細(xì)胞體積(MCV)；紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(MCH)；血紅蛋白(HGB)；白細(xì)胞(WBC)；淋巴細(xì)胞(LYM#)；血小板計數(shù)(PLT)(下同)

表4 1×劑量組給藥后0 d、3 d、7 d時血液學(xué)指標(biāo)值Tab 4 The Hematology of the 1× group on day 0,3,7 after

表5 3×劑量組給藥后0 d、3 d、7 d時血液學(xué)指標(biāo)值Tab 5 The Hematology of the 3× group on day 0,3,7 after

表6 5×劑量組給藥后0 d、3 d、7 d時血液學(xué)指標(biāo)值Tab 6 The Hematology of the 5× group on day 0,3,7 after

2.3.2 血清生化指標(biāo)檢查 1×、3×推薦劑量組奶牛在首次給藥前第0日和首次給藥后第3日和7日以及5×推薦劑量組奶牛首次給藥前第0日和首次給藥后3 d的血清生化數(shù)據(jù)與對照組奶牛不同采樣點(diǎn)時間獲得的血清生化指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)，之間無顯著差異(表7～表10)，但對于5×推薦劑量組奶牛，首次給藥后7 d，5頭奶牛中有2頭奶牛出現(xiàn)尿素氮和肌酐水平升高，說明5×推薦劑量注射給藥對部分奶牛腎臟功能有影響。

表7 空白對照組奶牛在首次給藥前第0日和首次給藥后第3日、第7日時血清生化指標(biāo)值Tab 7 The Blood Chemistry of the control group on day 0,3,7 after

續(xù)表

白蛋白(ALB)；堿性磷酸酶(ALKP)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)；血尿素氮(BUN)；膽固醇(CHOL)；肌酐(CREA)；直接膽紅素(DBIL)；葡萄糖(GLU)；總膽紅素(TBIL)；膽堿酯酶(CHE)；總蛋白(TP)(下同)

表8 1×劑量組奶牛在首次給藥前第0日和首次給藥后第3日、第7日時血清生化指標(biāo)值Tab 8 The Blood Chemistry of the 1× group on day 0,3,7 after

表9 3×劑量組奶牛在首次給藥前第0日和首次給藥后第3日、第7日時血清生化指標(biāo)值Tab 9 The Blood Chemistry of the 3× group on day 0,3,7 after

表10 5×劑量組奶牛在首次給藥前第0日和首次給藥后第3日、第7日時血清生化指標(biāo)值Tab 10 The Blood Chemistry of the 5× group on day 0,3,7 after

2.4 試驗?zāi)膛Ｈ橹w細(xì)胞數(shù) 各組試驗?zāi)膛Ｔ谑状谓o藥前第0日和首次給藥后第3日、第7日采集奶樣進(jìn)行SCC檢測，統(tǒng)計分析結(jié)果見表11。數(shù)據(jù)可見：在首次給藥前第0日和首次給藥后第3日、第7日各組試驗?zāi)膛５腟CC算術(shù)平均值均未超過50萬/mL，且組內(nèi)與組間不同時間點(diǎn)相比，統(tǒng)計學(xué)差異不顯著，而且體細(xì)胞數(shù)均在正常范圍內(nèi)，說明奶牛乳房處于健康狀態(tài)。

表11 試驗?zāi)膛Ｊ状卧诮o藥前第0日和首次給藥后第3日、第7日乳汁SCC檢測值比較Tab 11 The SCC in milk of each group on day 0 and 7 after

3 結(jié) 論

本試驗評估了氟尼辛葡甲胺注射液對奶牛的靶動物安全性，為該制劑在奶牛臨床中的使用提供了科學(xué)依據(jù)。美國食品藥品監(jiān)督管理總局(FDA)報道了先靈葆雅公司開發(fā)的氟尼辛葡甲胺注射液對肉牛靶動物安全性試驗研究[1]，試驗中分別給予1×(2.2 mg/kg bw)、3×(6.6 mg/kg bw)、5×(11.0 mg/kg bw)推薦劑量，每日靜脈注射1次，連續(xù)給藥9 d，結(jié)果顯示，3×和5×給藥劑量組動物的尿液中血細(xì)胞比例明顯增加，甚至出現(xiàn)尿液潛血的現(xiàn)象，這說明高劑量給藥對牛腎臟功能有影響。本研究中，氟尼辛葡甲胺注射液對奶牛的臨床癥狀、乳房局部癥狀、血液學(xué)指標(biāo)無影響，僅5×推薦劑量組在給藥后7 d，有2頭奶牛出現(xiàn)尿素氮水平升高，說明高劑量給藥對奶牛的腎臟功能有顯著影響，與FDA的報告基本一致。

國內(nèi)尚無氟尼辛葡甲胺注射液在奶牛上使用的安全性研究。吳文學(xué)[7]等的研究中采用15頭長白雜交商品豬，分為1×(1.1 mg/kg bw)、3×(3.3 mg/kg bw)、5×(5.5 mg/kg bw)推薦劑量組三個組，給藥后進(jìn)行臨床觀察、顯微病理和血液生化檢查，3×、5×劑量組豬注射部位局部輕度腫脹，5×劑量組豬的血紅蛋白值、淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和肌酐水平下降，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高，可見高劑量的氟尼辛葡甲胺會對豬的肝臟功能造成一定程度的影響。

在本文研究中，1×、 3×推薦劑量組奶牛分別給予2.2、6.6 mg/kg bw劑量的氟尼辛葡甲胺注射液，每日1次，連用7 d，所有奶牛的臨床癥狀、乳房局部癥狀、血液生理指標(biāo)和血清生化指標(biāo)均未受到影響，說明氟尼辛葡甲胺注射液臨床應(yīng)用于奶牛是安全的，不影響奶牛的正常生理功能，不會對奶牛產(chǎn)生治療外的影響。需要注意的是5×推薦劑量組給藥7 d后有2頭奶牛出現(xiàn)尿素氮、肌酐水平升高，尿素氮和血肌酐是腎功能的兩個重要指標(biāo)，這兩個指標(biāo)升高可能是由于微小循環(huán)損傷、腎小球損傷和基底膜損傷等主要病理變化所引起，由于未進(jìn)行病理剖檢，因此，未最終確診病理改變。由此得出，氟尼辛葡甲胺注射液超劑量長期使用會對奶牛的腎臟功能造成一定程度損傷，因此，在臨床使用中嚴(yán)禁超劑量長期使用。

參考文獻(xiàn)：

[1] https://www.fda.gov/downloads/AnimalVeterinary/Products/ApprovedAnimalDrugProducts/FOIADrugSummaries/ucm064905.pdf.

[2] http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Maximum_Residue_Limits_-_Report/2009/11/WC500014324.pdf.

[3] https://www.fda.gov/downloads/AnimalVeterinary/Products/ApprovedAnimalDrugProducts/FOIADrugSummaries/ucm064910.pdf.

[4] Thiry J,Gonzalez-Martin JV,Elvira L,et al. Treatment of naturally occurring bovine respiratory disease in juvenile calves with a single administration of a florfenicol plus flunixin meglumine formulation[J]. Vet Rec,2014,174(17):430.

[5] Guzel M, Karakurum M C, Durgut R, et al. Clinical efficacy of diclofenac sodium and flunixin meglumine as adjunts to antibacterial treatment of respiratory disease of calves[J]. Aust Vet J,2010,88(6):236-239.

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[7] 吳文學(xué)，王中杰，李金祥.新獸藥氟尼辛葡甲胺的研究[J]中國獸醫(yī)雜志，2006，42(1)：51-53.

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