表達豬瘟E2基因的重組偽狂犬病毒構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析

韓 爽，陳曉春，鄧 永，吳華偉，曹明慧，李俊平，夏業(yè)才

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)作為世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定必須報告的疫病，對世界養(yǎng)豬業(yè)造成極大危害，是養(yǎng)豬業(yè)防控的重要疾病[1]。因此，涉及豬病防控用新型疫苗的研究非常活躍。E2囊膜糖蛋白是豬瘟病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，介導(dǎo)病毒感染，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，是重要的保護性抗原[2]。因此，豬瘟E2蛋白是研制新型活載體疫苗、亞單位疫苗及研究豬瘟病毒致病機理的重要靶蛋白。已有研究表明，桿狀病毒表達E2亞單位滅活疫苗、重組豬瘟E2基因的腺病毒活載體疫苗、重組豬瘟E2基因的偽狂犬病毒活疫苗均表現(xiàn)出良好的免疫效果[3-6]。

偽狂犬病(Pseudorabies，PR或Aujeszky's disease，AD)是一種由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)感染引起的急性傳染病，可引起仔豬的高死亡率，母豬的繁殖障礙，育肥豬的神經(jīng)及呼吸系統(tǒng)癥狀，公豬的種用性能降低或喪失等，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大[7]。PRV基因組為線性雙鏈DNA，約145 kb，可編碼70～100種病毒蛋白，其中含有大量與病毒增殖無關(guān)的非必需區(qū)可供外源基因的插入，是優(yōu)良的活病毒載體[8]。PRV重組活疫苗對由與載體遺傳關(guān)系相近的PRV強毒引起的PR具有良好的免疫效果。

2011年以來，一度得到很好控制的豬偽狂犬病在我國又出現(xiàn)廣泛流行態(tài)勢。有研究表明，當(dāng)前流行毒株與之前的PRV毒株相比發(fā)生了較大變異，現(xiàn)使用的弱毒疫苗株無法對變異株的感染提供完全保護[9]?；赑RV流行情況的變化，實驗以CSFV(C株)的主要保護性抗原基因E2為目標(biāo)基因，用一株由PRV流行株(SX株)構(gòu)建的五基因缺失綠色熒光標(biāo)記病毒rPRV-BE[10]為親本株，通過同源重組技術(shù)構(gòu)建了表達豬瘟病毒E2基因的四基因缺失重組偽狂犬病毒rPRV-CSFV PE2SC，并對其體外增殖特性進行了初步研究，以期為重組病毒的進一步開發(fā)應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 毒株 PRV(SX株)為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測室人員在2012年于山西某豬場分離到的一株高致病性流行毒株；rPRV-BE，是以PRV(SX株)為基礎(chǔ)構(gòu)建的gI、gE、US9、TK和部分UL49.5基因缺失，引入增強型綠色熒光蛋白基因EGFP的重組病毒[10]；CSFV (C株)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏室保存。

1.2 細(xì)胞 PK15細(xì)胞，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。

1.3 載體及質(zhì)粒 pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司；pEASY-Blunt Simple Cloning Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pMD-US6-EGFP-US2由實驗室自行制備保存。

1.4 主要試劑 限制性內(nèi)切酶SbfI、AflII、AgeI、SpeI，T4 DNA連接酶購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司；Top10感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小提試劑盒、質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；EX-Taq酶、2×GC EX-Taq Buffer、dNTPs，One Step RT-PCR Kit購自寶生物工程(大連)有限公司；CSFV E2單抗為勃林格公司惠贈；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Sigrna(上海)貿(mào)易有限公司；DNA/RNA提取試劑盒購自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；KOD FX Neo購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。

1.5 主要儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱(三洋)、恒溫培養(yǎng)箱(三洋)、 水浴鍋(上海博信)、PCR儀(Biometra)、電泳儀(Bio-Rad)、熒光倒置顯微鏡(奧林巴斯)、凝膠成像系統(tǒng)(GOLD-SIM)等。

2 方 法

2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上的PRV和CSFV序列，自行設(shè)計合成系列擴增及鑒定引物(表1)，用于擴增左同源臂和gI基因、E2基因以及鑒定重組病毒。

表1 各片段擴增引物Tab 1 Sequences of PCR primer pairs

下劃線部分為引物酶切位點

The underline part is the enzyme cutting site

2.2 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-US6-US7-E2-US2的構(gòu)建

2.2.1 CSFV E2基因擴增 采用DNA/RNA提取試劑盒提取CSFV(C株)基因組，以其為模板用下游引物CSFVrE2R反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用引物CSFVrE2Fs/CSFVrE2R擴增E2基因，連接pEASY-Blunt Simple 克隆載體，構(gòu)建質(zhì)粒pEASY-Blunt-PE2S，測序正確后備用。

2.2.2 左同源臂+gI基因擴增 采用DNA/RNA提取試劑盒提取PRV(SX株)基因組，以其為模板，用引物rUS6F/rUS7R2擴增左同源臂和gI基因，擴增的目的片段連接pEASY-Blunt Simple克隆載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEASY-Blunt-US6-US7，測序正確后備用。

2.2.3 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建 質(zhì)粒pMD-US6-EGFP-US2與pEASY-Blunt-US6-US7經(jīng)SbfI/AflII雙酶切，回收目的片段后用T4連接酶連接，獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-US6-US7-EGFP-US2；再以AgeI/SpeI分別雙酶切質(zhì)粒pEASY-Blunt-PE2S和pMD-US6-US7-EGFP-US2，回收相應(yīng)片段后用T4連接酶連接，最終獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-US6-US7-E2-US2(構(gòu)建示意圖見圖1)，提取高濃度質(zhì)粒，備用于轉(zhuǎn)染。

2.3 重組病毒的拯救

2.3.1 同源重組 病毒的同源重組在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進行，取rPRV-BE病毒液15 μL，與3 μg轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-US6-US7-E2-US2采用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染長至90%左右的PK15細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)病變達80%以上后凍融裂解細(xì)胞，裂解液在PK15細(xì)胞上盲傳3代，出現(xiàn)無綠色熒光細(xì)胞病變即可初步判斷重組病毒拯救成功。

圖1 pMD-US6-US7-E2-US2轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建示意圖Fig 1 Schematic diagram of transfer carrier construction

2.3.2 重組病毒的篩選 將初步獲得的疑似含有CSFV E2基因的拯救病毒rPRV-CSFV PE2SC病毒液接種已長成良好單層的PK15細(xì)胞6孔細(xì)胞板，吸附1 h后，棄去吸附液，鋪上1%的低熔點瓊脂糖，繼續(xù)培養(yǎng)。接種48 h后在熒光顯微鏡下觀察，挑選無熒光的單個噬斑于0.5 mL DMEM營養(yǎng)液中，震蕩混勻后，繼續(xù)接種已長成良好單層的PK15細(xì)胞6孔細(xì)胞板，如此純化4次，將獲得的重組病毒命名為rPRV-CSFV PE2SC。

2.3.3 鑒定

2.3.3.1 基因鑒定 將獲得的重組病毒rPRV-CSFV PE2SC用PUS6dF/PUS9bR引物進行PCR鑒定，同時與野毒PRV(SX株)、親本毒rPRV-BE相同鑒定引物擴增結(jié)果進行比較。

2.3.3.2 免疫熒光鑒定 用針對CSFV E2蛋白的單克隆抗體(Mab)進行IFA試驗，檢測E2蛋白表達情況。將重組病毒rPRV-CSFV PE2SC接種PK15細(xì)胞96孔細(xì)胞板，待病變達到80%～90%時棄掉上清，經(jīng)滅菌PBS洗細(xì)胞2次后用80%冷丙酮固定，晾干后加入抗CSFV E2的Mab，置于濕盒中37 ℃作用1 h，再用PBS洗滌3次后，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，再次置于濕盒中37 ℃作用1 h，用PBS洗滌3次后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

2.4 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性研究 將篩選獲得的病毒rPRV-CSFV PE2SC在PK15細(xì)胞上連續(xù)傳20代，每5代提取感染細(xì)胞總DNA，按步驟2.3.3.1的方法進行PCR鑒定，重組病毒rPRV-CSFV PE2SC、第20代重組病毒rPRV-CSFV PE2SC按步驟2.3.3.2的方法進行IFA鑒定。

2.5 重組病毒一步生長曲線測定 將重組病毒rPRV-CSFV PE2SC、野毒PRV(SX株)、親本毒rPRV-BE，以0.01 MOI各接種PK15細(xì)胞12瓶，吸附1 h，用含有2%胎牛血清的DMEM補液后繼續(xù)培養(yǎng)，分別在感染后6、12、18、24、30、36、48、60、72、84、96、108 h收集感染細(xì)胞，凍融3次后收毒，分別測定三種病毒不同收毒時間的滴度并繪制一步生長曲線。

3 結(jié) 果

3.1 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建 質(zhì)粒pEASY-Blunt-US6-US7用SbfI/AflII雙酶切，切出大小約為2324 bp和3830 bp的兩個片段(圖2)；質(zhì)粒pEASY-Blunt-PE2S用AgeI/SpeI雙酶切，切出大小約為1208 bp和3830 bp的兩個片段(圖2)，與預(yù)期大小一致。經(jīng)測序，結(jié)果與理論序列一致，表明質(zhì)粒pEASY-Blunt-US6-US7和質(zhì)粒pEASY-Blunt- PE2S構(gòu)建成功。質(zhì)粒pMD-US6-US7-EGFP-US2用AgeI/SpeI能切出大小約為733 bp和6852 bp的兩個片段(圖3)，引入CSFV E2基因構(gòu)建的質(zhì)粒pMD-US6- US7- E2-US2，用AgeI/SpeI能切出大小約為1208 bp和6852 bp 的兩個片段(圖3)。經(jīng)測序，結(jié)果與理論序列一致，表明轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-US6-US7- EGFP-US2和pMD-US6-US7- E2-US2構(gòu)建成功。

3.2 重組病毒的拯救、純化及鑒定 轉(zhuǎn)染所收細(xì)胞裂解液，在PK15細(xì)胞上盲傳3代后出現(xiàn)了無綠色熒光細(xì)胞病變(圖4A)，初步判定重組病毒拯救成功。挑選無熒光的單個噬斑接種于長成良好細(xì)胞單層的PK15細(xì)胞，純化4次后獲得重組病毒rPRV-CSFV PE2SC(圖4B)。用引物PUS6dF/PUS9bR進行PCR鑒定，rPRV-CSFV PE2SC擴增到大小約為3469 bp的條帶，野毒PRV (SX株)和親本毒rPRV-BE用相同引物擴增，分別得到大小約為3550 bp和1584 bp的條帶(圖5)。經(jīng)測序證實，重組病毒缺失了EGFP基因，并成功引入了PRV gI基因和CSFV(C株) E2基因。

用針對CSFV E2蛋白的MAb進行IFA試驗，結(jié)果顯示，感染重組病毒rPRV-CSFV PE2SC的PK15細(xì)胞孔中出現(xiàn)明顯的熒光，而陰性對照組則沒有熒光出現(xiàn)(圖6)。

3.3 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性 重組病毒rPRV-CSFV PE2SC在PK15細(xì)胞上連續(xù)傳了20代，分別以重組病毒rPRV-CSFV PE2SC、第5、10、15、20代重組病毒DNA為模板，用引物PUS6dF/PUS9bR進行PCR擴增鑒定，結(jié)果均擴增出大小約為3469 bp的目的片段(圖7)。取重組病毒rPRV-CSFV PE2SC、第20代重組病毒進行免疫熒光鑒定，結(jié)果重組病毒rPRV-CSFV PE2SC、第20代重組病毒感染孔中均出現(xiàn)明顯的熒光(圖6、8)，且熒光亮度相似，表明重組病毒能夠穩(wěn)定遺傳。

M：Marker IV；1：pEASY-Blunt-PE2S的Age I/Spe I雙酶切產(chǎn)物；2：pEASY-Blunt-US6-US7的Sbf I/Afl II雙酶切產(chǎn)物M：Marker IV；1：pEASY-Blunt-PE2S enzyme digestion with Age I/Spe I；2：pEASY-Blunt-US6-US7 enzyme digestion with Sbf I/Afl II圖2 質(zhì)粒pEASY-Blunt-PE2S和pEASY-Blunt-US6-US7的雙酶切鑒定電泳圖Fig 2 The double enzyme digestion results of pEASY-Blunt-PE2S and pEASY-Blunt-US6-US7

M1：Marker IV；M2：Marker DL2000；1：pMD-US6-US7-EGFP-US2的Age I/Spe I雙酶切產(chǎn)物；2：pMD-US6-US7-E2-US2的Age I/Spe I雙酶切產(chǎn)物M1：Marker IV；M2：Marker DL2000；1：pMD-US6-US7-EGFP-US2 enzyme digestion with Age I/Spe I；2：pMD-US6-US7-E2-US2 enzyme digestion with Age I/Spe I圖3 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-US6-US7-EGFP-US2和pMD-US6-US7-E2-US2的雙酶切鑒定電泳圖Fig 3 The double enzyme digestion results of pMD-US6-US7-EGFP-US2 and pMD-US6-US7-E2-US2

A.盲傳出現(xiàn)的無綠色熒光細(xì)胞病變；B.純化得到的重組病毒rPRV-CSFV PE2SCA.Cytopathy without green fluorescence；B.Purified recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC圖4 篩選到的重組病毒rPRV-CSFV PE2SC(10×10)Fig 4 Screened recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC(10×10)

M：Marker DL5000；1：PRV(SX株)；2：rPRV-BE；3：rPRV-CSFV PE2SC圖5 重組病毒rPRV-CSFV PE2SC的PCR擴增鑒定電泳圖Fig 5 Identification of recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC by PCR

A.純化后的重組病毒rPRV-CSFV PE2SC感染PK15細(xì)胞；B.陰性對照A. Purified recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC infected PK15 cells；B. Negative control圖6 重組病毒rPRV-CSFV PE2SC 在PK15細(xì)胞中E2蛋白表達的IFA檢測結(jié)果Fig 6 Detection of E2 expression in PK15 cells infected with recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC by IFA

M：Marker DL5000；1：PRV(SX株)；2：rPRV-BE；3：rPRV-CSFV PE2SC；4：rPRV-CSFV PE2SC(P5)；5：rPRV-CSFV PE2SC(P10)；6：rPRV-CSFV PE2SC(P15)；7：rPRV-CSFV PE2SC(P20)圖7 重組病毒rPRV-CSFV PE2SC各代次PCR擴增鑒定電泳圖Fig 7 Identification of several generations of recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC by PCR

A.純化后的重組病毒rPRV-CSFV PE2SC第20代感染PK15細(xì)胞；B.陰性對照A.The 20th generation purified recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC infected PK15 cells；B. Negative control圖8 第20代重組病毒rPRV-CSFV PE2SC在PK15細(xì)胞中E2蛋白表達的IFA檢測結(jié)果Fig 8 Detection of E2 protein expression in PK15 cells infected with the 20th generation recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC by IFA

3.4 一步生長曲線測定 將重組病毒rPRV-CSFV PE2SC、野毒PRV(SX株)、親本毒rPRV-BE感染PK15細(xì)胞，6、12、18、24、30、36、48、60、72、84、96、108 h后所收病毒液分別進行病毒滴度測定，繪制了一步生長曲線(圖9)。結(jié)果表明，重組病毒rPRV-CSFV PE2SC在細(xì)胞內(nèi)增殖速度較快，接種后6 h滴度達101.7TCID50/mL，而且接種18 h之前滴度一直高于另外兩株毒，病毒滴度到達平臺期時間較快；最高滴度出現(xiàn)時間三株毒都在72 h，之后重組病毒rPRV-CSFV PE2SC的滴度開始下降，其最高滴度(106.7TCID50/mL)低于野毒PRV(SX株)的108.0TCID50/mL，與親本毒rPRV-BE(107.0TCID50/mL)相近，到達平臺后滴度下降比另外兩株病毒快。

圖9 重組病毒rPRV-CSFV PE2SC及野毒PRV(SX株)、親本毒rPRV-BE感染PK15細(xì)胞的一步生長曲線Fig 9 One step growth curve of recombinant virus rPRV-CSFV PE2SC，wild strain(PRV SX) and parental strain(rPRV-BE)

4 討 論

基因缺失的偽狂犬病毒因其具備安全性好、基因組容量大、培養(yǎng)簡單、免疫期長、宿主范圍廣等優(yōu)點，作為病毒載體極具開發(fā)潛力[11]。同時，隨著對偽狂犬病毒基礎(chǔ)研究的逐步深入，其作為重組表達載體的類型也越來越豐富。目前，已有豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV) GP5基因[12]、乙型腦炎病毒(JEV) NS1基因[13]、H3N2亞型豬流感病毒(SIV) HA基因[14]、犬瘟熱病毒(CDV) H基因[15]、豬細(xì)小病毒(PPV) VP2基因和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2) ORF2基因[16]等多種外源基因在偽狂犬病毒中獲得高效表達。

豬瘟發(fā)病率和死亡率較高，對養(yǎng)豬業(yè)危害很大，該病和偽狂犬病是目前威脅我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的兩種主要傳染病，如果防控不好，能夠造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。因此，開發(fā)一種安全有效的二價疫苗同時預(yù)防豬瘟和偽狂犬病兩種疾病，在實際生產(chǎn)中具有重要意義。Hooft等[17]于1996年構(gòu)建了表達豬瘟病毒囊膜蛋白E1的重組偽狂犬病毒二聯(lián)基因工程疫苗M402，該疫苗免疫豬后，能同時低抗CSFV和PRV 的強毒攻擊，展示了以基因缺失型偽狂犬病毒作為活病毒載體構(gòu)建重組疫苗的良好前景。除E1外，豬瘟病毒主要保護性抗原基因E2也是構(gòu)建重組病毒時優(yōu)先考慮的基因。重組豬瘟E2基因的偽狂犬病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2、rPRVTJ- delgE/gI/TK-E2、SA215(A)等[18-20]，均表現(xiàn)出良好的免疫原性。

gI、gE和TK基因已被證實與PRV致病性有關(guān)，是構(gòu)建PRV缺失株的主要靶基因，gI、gE雙基因缺失疫苗[18]，gI、gE和TK三基因缺失疫苗[19-20]已廣泛使用。近年來，對皰疹病毒的研究結(jié)果表明，US9形成KIF1A-US9復(fù)合物，介導(dǎo)病毒在神經(jīng)細(xì)胞中的順行傳導(dǎo)過程[21-23]，US9基因的缺失能降低PRV的毒力；UL49.5基因編碼囊膜蛋白gN，gN能抑制TAP介導(dǎo)的多肽往內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運，從而阻斷MHC I類復(fù)合體的裝配，下調(diào)其在細(xì)胞表面的表達，從而使病毒有可能逃避宿主CD8+T細(xì)胞的識別。1型牛皰疹病毒(BHV-1)UL49.5胞質(zhì)尾缺失和胞外域30～40aa部分缺失能增強病毒侵染宿主的能力，誘導(dǎo)更強的細(xì)胞免疫和體液免疫[24]，在疫苗研制方面更具優(yōu)勢，為偽狂犬病毒缺失株的構(gòu)建提供了新思路。同時，gI、gE都屬于糖蛋白，可以產(chǎn)生中和抗體，保留gI有助于提高PRV的免疫原性。因此，兼顧降低PRV的致病性、提高PRV免疫原性和保證目的基因的高效表達，構(gòu)建成功了TK、gE、US9全基因缺失及部分gN基因缺失，表達豬瘟病毒(CSFV C株) E2蛋白的重組偽狂犬病毒rPRV-CSFV PE2SC。

重組病毒rPRV-CSFV PE2SC在PK15細(xì)胞傳20代后，PCR及IFA檢測其插入和缺失不變，該結(jié)果與周國輝等[14]構(gòu)建的表達H3N2亞型豬流感病毒HA基因的重組偽狂犬病毒rPRV-HA，Lei等[19]構(gòu)建的重組病毒rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2株的研究結(jié)果一致，表明這種插入和缺失是穩(wěn)定的。重組病毒能在PK15細(xì)胞中快速增殖，到達平臺期時間早，病毒滴度峰值可達106.7TCID50/mL，與方六榮等[12]構(gòu)建的表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)GP5的重組偽狂犬病毒TK-/gG-/GP5+株(107.2TCID50/mL)，Wang等[18]構(gòu)建的rPRVTJ-delgE/gI-E2株(107.0TCID50/mL)的實驗結(jié)果相近。而且重組病毒rPRV-CSFV PE2SC最高滴度與親本毒rPRV-BE相近，低于野毒PRV(SX株)的實驗結(jié)果與Wang等[18]構(gòu)建的rPRVTJ-delgE/gI-E2株的實驗結(jié)果相一致。因此，用偽狂犬病毒作為載體構(gòu)建含有豬瘟E2基因的重組活載體疫苗株，在理論和實踐上均是可行的。研究結(jié)果為表達豬瘟E2基因重組偽狂犬病毒rPRV-CSFV PE2SC的進一步開發(fā)應(yīng)用提供了依據(jù)。

除此之外，基因缺失的疫苗株免疫動物后，不產(chǎn)生針對缺失蛋白的抗體；重組疫苗只產(chǎn)生針對重組CSFV E2蛋白的抗體，不會產(chǎn)生針對CSFV其他蛋白的抗體，所以可以通過血清學(xué)的方法將疫苗免疫豬和野毒感染豬加以區(qū)分[25]，可為CSFV和PRV根除計劃的實施提供技術(shù)保障。

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