黃芪發(fā)酵前后黃酮含量及指紋圖譜比較研究

侯美如，尹珺伊，王 巖，劉 宇，陳楠楠，秦平偉，史同瑞，楊淑萍

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006)

黃芪是我國一種傳統(tǒng)藥材，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢的干燥根。性溫、味甘，為常用補(bǔ)氣藥。黃芪含黃酮類、多糖類、皂苷類、氨基酸及多種微量元素等活性成分。其中，黃酮類是含量較高的一類成分，具有清除自由基、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒等多方面的藥理作用，是黃芪中重要的有效成分，因此黃酮類成分常作為黃芪藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)之一，黃酮化合物主要包括毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、刺芒柄花苷及芒柄花素等[1]。為此，選擇以上4種黃酮作為參考指標(biāo)，用于評價固體發(fā)酵對黃芪成分的影響。

中藥發(fā)酵作為中藥加工的一種炮制工藝已具有悠久的歷史，目前，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)酵轉(zhuǎn)化中藥也已成為中藥領(lǐng)域的研究熱點。應(yīng)用具有分解和轉(zhuǎn)化能力的微生物發(fā)酵中藥，可保護(hù)中藥活性成分免受煎、煮、熬、煉、蒸、浸等傳統(tǒng)工藝造成的破壞，能夠提高中藥有效成分的提取率，降解中藥大分子物質(zhì)，產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，降低中藥毒副作用[2-4]。然而，發(fā)酵中藥作為中藥產(chǎn)品的一種新型制劑尚無規(guī)范性的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，這嚴(yán)重影響了發(fā)酵中藥質(zhì)量的有效控制和臨床應(yīng)用。隨著，液相色譜技術(shù)的發(fā)展，為探究中藥發(fā)酵前后成分及含量的變化提供了有效手段。在適宜的色譜條件下，可將中藥中不同成分在不同時間節(jié)點洗脫，并由檢測器檢測，從而直觀的顯示出中藥不同成分及相對含量，這為比較發(fā)酵前后成分差異提供了可靠依據(jù)[5]。研究應(yīng)用HPLC-UV方法，對產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽胞桿菌發(fā)酵黃芪散劑中4種黃酮含量及色譜圖進(jìn)行了比較，旨在為其質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐，為生產(chǎn)應(yīng)用提供質(zhì)量保障。

1 材料與方法

1.1 儀器 日本島津SPD-20A紫外檢測器，LC-20AT二元泵，Labsolution色譜工作站,日本島津公司產(chǎn)品；KQ5200B超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；ZNCL-S自能恒溫磁力攪拌器，上海羌強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PINE-TREE帕恩特標(biāo)準(zhǔn)試劑級超純水機(jī)，北京湘順源科技有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩器HZQ-FX型，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.2 菌株與試劑 產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽胞桿菌SSYB株，由本研究室分離鑒定并保存；刺芒柄花苷、芒柄花黃素含量、毛蕊異黃酮苷含量、毛蕊異黃酮(含量均≥98%，批號分別為：R04J6F2、KO1014CB14、PS0912SA13、P29M6R2)，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；黃芪，河北凱達(dá)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純，批號：20161210)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；甲醇(色譜純，批號：20161108),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品毛蕊異黃酮苷7.9 mg，刺芒柄花苷3.2 mg，毛蕊異黃酮2.9 mg，芒柄花素6.1 mg，置于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲溶解，定容至刻度，備用。

1.3.2 發(fā)酵黃芪及對照品制備 發(fā)酵黃芪：按照黃芪粉30%、黃豆粉10%、CaCO30.2%、水59.8%組分制備發(fā)酵培養(yǎng)基。取解淀粉芽孢桿菌種子液，以2%接種量接種黃芪發(fā)酵培養(yǎng)基，在37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)72 h，發(fā)酵物中活菌數(shù)約為7.67×108CFU/g。

對照黃芪：另外取無菌肉湯，按2%接種量接種黃芪固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，按照發(fā)酵黃芪制備方法進(jìn)行處理。

1.3.3 成分提取 取發(fā)酵黃芪與非發(fā)酵黃芪各5 g，分別加入甲醇30 mL，超聲提取30 min，重復(fù)提取3次，合并提取液，于70 ℃水浴揮干溶劑，加8 mL甲醇溶液超聲溶解，待完全溶解后定容至10 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，超聲除氣，備用。

1.3.4 檢測方法建立

1.3.4.1 色譜條件 Inertsustain C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈和水，檢測波長：254 nm，柱溫：25℃，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Conditions of gradient elution

1.3.4.2 適應(yīng)性考察 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)超聲，過0.45 μm濾膜后進(jìn)樣20 μL，考察4種黃酮對上述色譜條件的適應(yīng)性。

1.3.4.3 線性關(guān)系考察 用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別為原濃度的1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64倍，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，超聲除氣，備用。按上述色譜條件對毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素4種黃酮含量進(jìn)行測定，以液相色譜峰峰面積(A)對濃度(mg/L)(C)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.4 精密度試驗 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL，

重復(fù)進(jìn)針6次，測定4種黃酮峰面積，對精密度試驗進(jìn)行考察。

1.3.4.5 穩(wěn)定性試驗 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別于放置0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)針1次，測其峰面積，對穩(wěn)定性試驗進(jìn)行考察。

1.3.5 黃酮含量的測定 取發(fā)酵黃芪及對照黃芪提取液各20 μL，按上述色譜條件對兩種提取液樣品中的黃酮含量進(jìn)行測定。

2 結(jié) 果

2.1 檢測方法建立

2.1.1 適應(yīng)性考察 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)超聲，過0.45 μm濾膜后進(jìn)樣20 μL，結(jié)果見圖1。毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)品分別在13.024、21.102、26.900、40.749 min出現(xiàn)獨立峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。發(fā)酵組及對照組中的目標(biāo)峰分離效果較好，且對不同成分峰的分離程度較為理想，可用于比較黃芪發(fā)酵前后成分的變化。

Ⅰ：毛蕊異黃酮苷；Ⅱ：刺芒柄花苷；Ⅲ：毛蕊異黃酮；Ⅳ：芒柄花素Ⅰ：Calycosin 7-O-glucoside；Ⅱ：Ononin；Ⅲ：Calycosin；Ⅳ：Formononetin圖1 標(biāo)準(zhǔn)品(A)、黃芪發(fā)酵組(B)及黃芪對照組(C)色譜圖Fig 1 Standard product chromatogram (A), Astragalus fermentation chromatogram (B) and Radix astragalus chromatogram(C).

2.1.2 線性關(guān)系考察 按上述色譜條件對毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素4種黃酮含量進(jìn)行測定，以液相色譜峰峰面積(A)對濃度(mg/L)(C)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立回歸方程，分別為：AⅠ=640.91C+246.75(r=0.9992)；AⅡ=716.96C+174.57(r=0.9991)；AⅢ=119.86C+253.17(r=0.9995)；AⅣ=1270.93C+194.64(r=0.9992)。結(jié)果表明，4種黃酮色譜峰面積與濃度呈良好線性的濃度范圍分別是12.34～790、5.0～320、4.53～290、9.53～610 mg/L。

2.1.3 精密度試驗 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)針6次，測定4種黃酮峰面積。RSD分別為1.21%、0.98%、1.64%和1.12%。結(jié)果表明，進(jìn)樣精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別于放置0、2、4、6、8、10 h進(jìn)針1次，測其峰面積。4種黃酮峰面積的RSD分別為1.42%、1.03%、1.83%和1.34%。結(jié)果表明，供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 黃酮含量的測定 取發(fā)酵黃芪及對照黃芪提取液各20 μL，按上述色譜條件對兩種提取液樣品中的黃酮含量進(jìn)行測定。由表2可知，發(fā)酵黃芪與對照黃芪提取液中均含有黃酮中的3種成分，即毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素。發(fā)酵黃芪含量分別為12.236±0.232、0.201±0.021和0.737±0.041 mg/g；對照黃芪含量分別為0.327±0.013、5.453±0.078和12.847±0.118 mg/g。發(fā)酵黃芪中毛蕊異黃酮苷含量顯著高于對照黃芪(P<0.01)，而毛蕊異黃酮和芒柄花素含量顯著低于對照黃芪(P<0.01)。

表2 黃芪發(fā)酵前后4種黃酮含量Tab 2 The content of four flavonoids before and after

“-”未在相對保留時間出現(xiàn)色譜峰

2.3 發(fā)酵黃芪色圖譜比對 發(fā)酵黃芪與對照黃芪色譜圖比較發(fā)現(xiàn)，兩者指紋圖譜差異較大，相似度低，說明黃芪經(jīng)發(fā)酵后成分發(fā)生了很大變化，見圖2。經(jīng)比對分析可知，發(fā)酵黃芪與對照黃芪保留時間點一致的吸收峰(RSD<1%)共有15個，占出峰總數(shù)的30%～33%，但相同保留時間點的吸收峰面積差異較大，其中，在0.928、1.326、9.017、14.762、22.538、24.850、41.657 h 7個保留時間點，發(fā)酵黃芪的吸收峰面積均較對照黃芪有所增大，增大幅度為170%～810%，差異極顯著(P<0.01)。而另8個保留時間點的吸收峰面積均較對照黃芪縮小，其中，有1個保留時間點的吸收峰面積縮小69.08%，其它7個保留時間點均縮小90%以上。

以大于色譜峰總面積2%的單峰為目標(biāo)峰，發(fā)酵黃芪中有8個，而對照黃芪有15個，其中，發(fā)酵黃芪在1.560、1.752、2.604、3.279、8.338、39.546 h出現(xiàn)6個新的吸收峰，而在1.675、1.965、2.417、5.240、7.779、17.988、20.109 h的7個原有吸收峰消失。此外，與對照黃芪比較，發(fā)酵黃芪在1.560、1.752 h新出現(xiàn)2個極高峰，其峰面積分別占總面積的33.4%、22.2%，而在1.965 h點處峰面積占總面積23.29%的1個原有極高峰消失，見圖3、圖4。試驗結(jié)果表明，黃芪發(fā)酵后產(chǎn)生了許多新的特征吸收峰，同時原有的多數(shù)吸收峰消失，這說明黃芪經(jīng)發(fā)酵后，原有成分及含量發(fā)生了變化，一些原有成分消失，同時也產(chǎn)生了新的物質(zhì)。

數(shù)據(jù)1：發(fā)酵黃芪色譜圖；數(shù)據(jù)2：對照黃芪色譜圖Data1 Fermentation of astragalus chromatogram;Data2 Control of astragalus chromatogram圖2 黃芪發(fā)酵前后液相色譜對比圖Fig 2 Comparison diagram of liquid chromatography before and after fermentation of astraglus

圖3 發(fā)酵黃芪色譜圖Fig 3 Fermentation of astragalus chromatogram

圖4 黃芪色譜圖Fig 4 Astragalus chromatogram

3 討論與小結(jié)

中藥發(fā)酵制品多以主要有效成分及其含量為質(zhì)量控制制備，然而由于中藥成分繁多，生物發(fā)酵過程復(fù)雜，僅以中藥主要活性成分含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)難以保證中藥制品質(zhì)量。一些學(xué)者提出，采用中藥色譜指紋圖譜技術(shù)，對中藥及其制品進(jìn)行整體性的質(zhì)量控制與評價。史玉霞[6]運(yùn)用檢測波長254 nm，乙腈-磷酸為流動相，梯度洗脫，對何首烏提取液益生菌發(fā)酵前后化學(xué)成分進(jìn)行研究，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.7%，該方法穩(wěn)定性好，為評價何首烏藥材不同炮制品的質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。李崗[7]等運(yùn)用HPLC法對消栓口服液發(fā)酵前后指紋圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者指紋圖譜間差異較大，相似度低，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”對15批樣品進(jìn)行相似度評價，結(jié)果符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。本試驗采用乙腈和水為流動相，梯度洗脫，檢測波長254 nm，柱溫25 ℃；流速1 mL/min，在此條件下，檢測發(fā)酵黃芪與對照黃芪樣品，結(jié)果目標(biāo)峰及其他成分峰分離效果好，適于比較發(fā)酵黃芪成分的變化。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品在液相色譜中形成的目標(biāo)峰，可以判斷樣品對應(yīng)色譜峰的物質(zhì)[8]。試驗選擇了黃芪中4種黃酮成分作為參考指標(biāo)，評估生物發(fā)酵對黃芪成分及其含量的影響。在檢測的4種黃酮成分中，發(fā)酵黃芪毛蕊異黃酮苷含量顯著升高，而毛蕊異黃酮和芒柄花素含量顯著降低。這說明黃芪發(fā)酵后，一些物質(zhì)轉(zhuǎn)化生成為毛蕊異黃酮苷，而毛蕊異黃酮和芒柄花素基本被轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。黃芪經(jīng)發(fā)酵后，雖然有15種成分未被全部轉(zhuǎn)化利用，但其含量發(fā)生了顯著變化，其中，有7種成分含量較對照黃芪升高了1.7～8.1倍，而另8種成分含量卻顯著降低，且其中7種成分近于消失。在單峰面積大于色譜峰總面積2%的15種成分中，黃芪經(jīng)發(fā)酵后有7種成分消失，其中包括一種含量占23.29%的主要物質(zhì)，同時又生成6種新物質(zhì)，且有兩種新生主要物質(zhì)，含量分別為33.4%、22.2%，為進(jìn)一步考察黃芪中其他主要成分的變化，實驗也分別運(yùn)用紫外分光光度法及液相色譜法對黃芪多糖、黃芪甲苷發(fā)酵先后質(zhì)量變化進(jìn)行了測定，對比發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后黃芪多糖及黃芪甲苷的含量均有升高，分別為升高了39.59%[9]、37.59%。由此推測，解淀粉芽孢桿菌生長代謝能將黃芪成分轉(zhuǎn)化、利用，同時也產(chǎn)生了一些新物質(zhì)，這一結(jié)果被許多學(xué)者研究證實。阮鳴等[10]研究表明，在黃芪發(fā)酵過程中，黃芪甲苷被轉(zhuǎn)化形成6-O-B-D-葡萄糖基-環(huán)黃芪醇，該轉(zhuǎn)化物具有顯著的抗氧化效應(yīng)，具有增效的作用。肖麗麗等[11]經(jīng)薄層層析檢測證實，生物發(fā)酵可將黃芪總皂苷中的部分皂苷轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷。

發(fā)酵中藥作為一種中藥新產(chǎn)品尚無規(guī)范性的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，這嚴(yán)重影響了發(fā)酵中藥質(zhì)量的有效控制和臨床應(yīng)用，本文運(yùn)用HPLC法，通過對解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵黃芪有效成分及色譜圖對比，發(fā)現(xiàn)黃芪發(fā)酵前后其成分發(fā)生了很大變化，但究竟轉(zhuǎn)化利用了何物質(zhì)，以及產(chǎn)生了何種新物質(zhì)及其發(fā)生機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。中藥成分復(fù)雜，要準(zhǔn)確測定其各成分及含量難度較大，測定中藥指紋圖譜，可初步確定中藥化學(xué)組成及含量差異。在中藥指紋圖譜測定中，高效液相色譜法具有流動相選擇廣，色譜柱可反復(fù)利用，簡便，快速等特點，因此，本文對產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽胞桿菌發(fā)酵黃芪的一些成分及色譜圖進(jìn)行了研究，旨在為發(fā)酵黃芪制品質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。

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