頭穴透刺對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織TLR-4蛋白表達(dá)的影響*

吳明娟，趙 巖△，孫曉偉，張 雪，沙麗麗

(1．黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

缺血性腦血管病是最常見(jiàn)的腦血管疾病，發(fā)病率、死亡率、致殘率較高，是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命和生存質(zhì)量的一類(lèi)重大疾病[1-3]。而腦缺血再灌注損傷是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程，包括腦組織代謝異常、自由基生成、腦組織炎性反應(yīng)等多個(gè)環(huán)節(jié)。其中腦組織炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷發(fā)生的重要機(jī)制之一[4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4(toll-like receptors,TLR-4)蛋白與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)[5-6]。本研究通過(guò)復(fù)制大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血2 h再灌注模型，以觀察頭穴透刺對(duì)大鼠腦缺血再灌注后炎癥因子TLR-4蛋白表達(dá)的影響，從而探尋頭穴透刺對(duì)腦缺血再灌注損傷的可能抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

取清潔級(jí)健康雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量(250±30)g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、頭針組3組，其中假手術(shù)組10只(其中用于免疫組化檢測(cè)5只，用于Western blot檢測(cè)5只)，模型組和頭針組各30只(其中用于免疫組化檢測(cè)15只，用于Western blot檢測(cè)15只)。模型組與頭針組再根據(jù)缺血2 h再灌注后的時(shí)間不同分為3個(gè)亞組(再灌注后1天、再灌注后3天、再灌注后7天)，每個(gè)亞組各10只大鼠。

1.2 模型的建立

模型組與頭針組均采用改良的Zea Longa線栓法[7]，建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻斷的缺血2 h再灌注模型，栓塞2 h后拔出栓子，恢復(fù)血供，實(shí)現(xiàn)再灌注；假手術(shù)組不中斷大腦中動(dòng)脈的血流，僅將線栓插入12 mm。

1.3 各組干預(yù)方法

在造模2 h時(shí)，頭針組給予每日1次頭針治療。參照華興邦等《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》：取大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻斷側(cè)百會(huì)穴透曲鬢穴，進(jìn)針深度約為0.8寸，實(shí)施小幅度捻轉(zhuǎn)手法200轉(zhuǎn)/min，持續(xù)5 min，每間隔5 min重復(fù)捻轉(zhuǎn)1次，共留針30 min。造模后的假手術(shù)組和模型組大鼠為保證和針刺組的大鼠飼養(yǎng)條件相同，針刺組每天治療時(shí)其余兩組不作治療，但要抓取并固定1次，每次30 min。

1.4 免疫組化檢測(cè)

各組5只大鼠在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行腹腔注射麻醉(10%水合氯醛35 mg/kg)后，經(jīng)心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛固定后取腦，切取視交叉前2 mm至視交叉后2 mm的腦組織塊，用4%多聚甲醛4℃后固定過(guò)夜，用于作石蠟包理切片，片厚4 um。將4 um石蠟切片進(jìn)行脫蠟、脫水、抗原修復(fù)、滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、血清封閉內(nèi)源性抗原，加入一抗(兔抗NF-κB抗體1∶500、兔抗TNF-α抗體1∶500)4℃孵育過(guò)夜，次日二抗孵育30 min、DAB顯色、蘇木素染核、酒精梯度透明、封片，顯微鏡分別選取5個(gè)不同視野以計(jì)算TLR-4蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5 Western blot檢測(cè)

各組5只大鼠在再灌注后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，斷頭取腦。將腦組織進(jìn)行蛋白抽提，用 BCA 法進(jìn)行蛋白定量：蛋白變性、電泳分離、轉(zhuǎn)膜、膜封閉、一抗4℃孵育(1∶500稀釋)、過(guò)夜、孵育二抗(室溫孵育1 h)、顯色。采用分析軟件進(jìn)行定量測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠缺血側(cè)腦組織TLR-4免疫組化染色結(jié)果

假手術(shù)組大鼠可見(jiàn)到TLR-4輕度表達(dá)，模型組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)模型陽(yáng)性表達(dá)增多現(xiàn)象，模型組與假手術(shù)組兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組各時(shí)間點(diǎn)TLR-4高度表達(dá)，且均高于假手術(shù)組(P<0.05)，模型組術(shù)后3天TLR-4表達(dá)達(dá)高峰，隨后開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，7天時(shí)TLR-4陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)仍高于假手術(shù)組。頭針組可見(jiàn)TLR-4蛋白陽(yáng)性表達(dá)，與模型組比較明顯下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)封三彩圖1、表1。

表1 各組大鼠缺血側(cè)腦組織TLR-4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

注：與假手術(shù)組比較，☆P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠缺血側(cè)腦組織TLR-4表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果

假手術(shù)組大鼠缺血側(cè)腦組織中TLR-4蛋白含量較低，僅為0.28±0.007。模型組大鼠在再灌注1天，缺血側(cè)腦組織中TLR-4蛋白含量即出現(xiàn)明顯增加，為0.46±0.009；至再灌注3天達(dá)高峰，隨后含量有所減低，再灌注7天時(shí)其含量降為0.43±0.006，但仍明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。而頭針組大鼠在再灌注后各時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)腦組織中TLR-4蛋白含量均較同期模型組明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

表2 各組大鼠缺血側(cè)腦組織TLR-4表達(dá)相對(duì)蛋白含量比較

注：與假手術(shù)組比較，☆P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

圖2 各組大鼠缺血側(cè)腦組織TLR-4蛋白條帶及相對(duì)含量比較

3 討論

腦缺血再灌注損傷(CIRI)是指腦缺血恢復(fù)血液供應(yīng)后，功能未能恢復(fù)反而出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的腦功能障礙[8]。局灶性腦缺血再灌注后，有多種病理生理機(jī)制對(duì)腦組織造成損傷，其中炎癥反應(yīng)在局灶性腦缺血再灌注損傷中擔(dān)當(dāng)重要角色[9]。而再灌注損傷可激活Toll樣受體4(TLR-4)，TLR-4的活化可引起促炎因子的分泌[10]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，TLR-4參與了腦缺血再灌注損傷的發(fā)病過(guò)程，且在其中發(fā)揮著重要的作用，TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活，可導(dǎo)致其下游炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的上調(diào)[11]。因此，TLR-4是缺血再灌注損傷過(guò)程中的重要介質(zhì)之一，早期阻斷TLR-4蛋白的表達(dá)是防治腦缺血再灌注損傷的有效途徑之一。

TLR-4屬于I型跨膜受體蛋白，是Toll樣受體(TLR)家族的主要成員之一。TLR-4分為胞外和胞內(nèi)區(qū)，其中胞外區(qū)負(fù)責(zé)辨別病原菌或內(nèi)源性配體;而胞內(nèi)區(qū)具有TIR結(jié)構(gòu)域，主要作用是介導(dǎo)細(xì)胞啟動(dòng)應(yīng)答信號(hào)，參與炎癥的病理反應(yīng)。膜結(jié)合蛋白TLR-4與配體結(jié)合后，導(dǎo)致胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域與胞內(nèi)銜接蛋白MyD88結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)下游IRAK磷酸化，繼而激活腫瘤壞死因子(TNF)及受體相關(guān)因子(TRAF)[12-13]，激活核因子(NF)-κB，促進(jìn)多種炎癥因子的表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生[14-15]。

本研究結(jié)果表明腦缺血再灌注后缺血側(cè)腦組織中TLR-4蛋白出現(xiàn)明顯的反應(yīng)性增多和表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明腦缺血再灌注可激活TLR-4蛋白的表達(dá)。而在缺血再灌注后早期運(yùn)用頭針干預(yù)可降低TLR-4蛋白的表達(dá)，表明百會(huì)透曲鬢頭針療法減輕腦缺血再灌注后的相關(guān)級(jí)聯(lián)損傷的機(jī)制可能與抑制TLR-4的表達(dá)有關(guān)。綜上推測(cè)百會(huì)透曲鬢頭針療法可能通過(guò)抑制TLR-4的表達(dá)，降低缺血再灌注后的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)揮保護(hù)受損神經(jīng)的作用，為臨床防治缺血性腦血管病提供了新的思路。

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