頭穴叢刺法對腦缺血再灌注大鼠腦組織BDNF、p75NTR表達的影響*

田嘉琦,董曉紅,王悅陽,韓玉生△

(1.香港浸會大學，香港 999077;2.黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154000；3.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

缺血性腦血管疾病治療的關(guān)鍵是恢復腦組織的血流灌注，但在腦血流再灌注過程中會有腦組織嚴重損傷的情況發(fā)生，多年的研究證實頭穴叢刺法對腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元損傷有保護作用[1-3]。本研究探討采用頭穴叢刺法對大鼠腦缺血再灌注(MCAO/R)模型腦組織中腦源性BDNF和p75(p75NTR)表達水平的影響及其治療腦缺血再灌注損傷的機制，以期為臨床治療提供有益的補充。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量(250±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供,許可證號：SCXK(魯)20140001。在安靜環(huán)境下適應性飼養(yǎng)1周，室溫(22±2)℃，相對濕度55%～60%。給予充足清潔飲水，自由攝食。

1.2 主要試劑及儀器

蛋白抽提試劑、BCA蛋白定量試劑盒均由賽諾博公司提供；兔抗大鼠BDNF及p75NTR多克隆抗體，Abcam公司；GAPDH抗體、HRP標記山羊抗小鼠/兔IgG、蛋白marker購自武漢博士德；免疫組化PV二步法試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉；TaKaRa PrimeScript RT-PCR Kit、TaKaRa DL2,000 DNA Marker購自中國大連寶生物工程有限公司；PCR擴增引物購自中國上海捷瑞生物工程有限公司；其余為國產(chǎn)分析純。

北京普朗DNM-9602型酶標儀；德國菜卡2135型組織切片機，；美國Motic公司 Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)； Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)；科大創(chuàng)新低溫高速離心機；武漢格萊莫DT1001型電子天平；北京六一DYY-6C 型恒壓恒流電泳儀；美國Forma-ThermoForma725；以色列MiniLumi公司凝膠成像系統(tǒng)；美國Bio-Rad公司全自動梯度PCR儀。

1.3 模型制備與評價

采用線栓法制備大鼠MCAO/R模型[4]，并于缺血2 h后進行再灌注。再灌注后大鼠完全清醒，參照Zea Longa 5級評分標準[5]進行神經(jīng)功能評價，1～3分者表明模型制備成功，納入實驗?？瞻讓φ战M未做處理，假手術(shù)組僅未插入釣魚線，其余步驟同上。

1.4 分組、取穴及針刺方法

模型制備完成后的大鼠經(jīng)神經(jīng)功能評分篩選后，采用隨機數(shù)字法分為模型對照組和針刺組，每組各12只。另選取空白對照組和假手術(shù)組大鼠各12只。

針刺組采用頭穴叢刺法，在再灌注后2 h即開始針刺，取穴方法參照《實驗針灸學》[6]和《大鼠穴位圖譜》[7]，定位大鼠百會穴及其左右各旁開2 mm處，采用0.25 mm×25 mm針灸針朝大鼠鼻尖方向進行平刺，快速捻轉(zhuǎn)1 mim后，留針0.5 h，每12 h針1次，連續(xù)針刺10次。針刺結(jié)束后30 min采集相關(guān)樣本。除針刺組外其余各組不做針刺處理。

1.5 檢測指標

1.5.1 神經(jīng)功能缺損評分 再灌注模型制備完成大鼠完全清醒后和末次針刺治療30 min后，參照Zea Longa 5級評分標準[5]，對各組大鼠分別進行神經(jīng)功能缺損評分。

1.5.2 免疫組織化學法檢測腦缺血周圍組織中BDNF和p75NTR陽性蛋白的表達 最后一次針刺治療30 min后，用10%水合氯醛腹腔注射對大鼠進行麻醉，將腦組織完整取出后，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，然后存放于4℃冰箱中備用。將腦組織根據(jù)實驗需要修塊后按照石蠟包埋步驟進行常規(guī)包埋，使用組織切片機將包埋的組織切成厚度為5 μm的切片，采用免疫組化PV二步法對腦組織中BDNF和p75NTR蛋白表達進行檢測。使用Motic3000顯微攝影系統(tǒng)對染色后的組織切片進行拍照，調(diào)整放大倍數(shù)為400倍，再采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對腦組織的BDNF和p75NTR蛋白陽性表達進行定量分析，按照公式積分光密度(IOD)=陽性面積×平均光密度來計算，以積分光密度(IOD)代表實驗所檢測陽性蛋白的相對表達量。每組均對6張腦組織切片進行分析，隨機選取每張腦組織切片的3個不同的高倍鏡視野，用平均值表示該張切片蛋白的相對表達量。

1.5.3 Western-blot法檢測腦組織中BDNF、p75NTR蛋白的表達 取液氮凍存的缺血區(qū)腦組織0.5 g放入瓷研缽中,加入少許液氮預冷后，將腦組織反復研磨成極細的粉末，加入蛋白抽提劑將蛋白提出，采用BCA法對蛋白進行定量，根據(jù)實驗需要調(diào)整蛋白濃度，然后按照Western-blot檢測步驟對BDNF和p75NTR蛋白的含量進行檢測，每孔的上樣量為20 ug，BDNF和p75NTR一抗的濃度均為1∶2 000，二抗的濃度均為1∶10 000。最后采用凝膠成像系統(tǒng)掃描底片并進行分析,以對照蛋白條帶與目的蛋白條帶的光密度的比值大小來代表目的蛋白的相對蛋白含量。

1.5.4 Realtime-PCR法檢測大鼠腦組織中BDNF、p75NTR mRNA表達 取液氮凍存的缺血區(qū)腦組織0.5 g放入瓷研缽中,加入少許液氮預冷后，研磨成極細的粉末。TRNzol總RNA提取試劑進行樣本RNA提取，采用Realtime-PCR法檢測大鼠腦組織中BDNF、p75NTR mRNA 的表達進行檢測，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。BDNF和p75NTR引物設計及合成由上海捷瑞生物工程有限公司提供。各樣品的目的基因和內(nèi)參分別進行Realtime-PCR反應，每個樣本檢測3個復孔。2-△△CT法是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法，本實驗數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析，計算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，即其他各個樣品相對于對照樣品目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分的比較

與假手術(shù)組相比較，模型對照組和針刺組大鼠神經(jīng)功能評分明顯增加，有統(tǒng)計學意義，P<0.01；與模型對照組相比較，針刺組針刺治療后，神經(jīng)功能評分明顯減少，有統(tǒng)計學意義，P<0.01。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01;與模型對照組比較，##P<0.01

2.2 免疫組化法檢測大鼠腦組織中BDNF、p75NTR蛋白的表達

免疫組化法顯示，缺血區(qū)周圍腦組織中BDNF、p75NTR蛋白主要表達在神經(jīng)細胞的胞質(zhì)中，淡黃色、黃色或棕黃色為陽性表達。與空白對照組相比較，模型對照組及針刺組大鼠缺血區(qū)周圍腦組織中BDNF和p75NTR蛋白陽性表達水平均明顯增加(P<0.01);與模型對照組比較，針刺組大鼠缺血區(qū)周圍腦組織中BDNF蛋白陽性表達水平明顯增加，而 p75NTR蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 免疫組化法檢測各組大鼠腦組織中BDNF、p75NTR蛋白表達水平

2.3 Western-blot法檢測大鼠腦組織中BDNF、p75NTR蛋白的表達

與空白對照組比較，模型對照組及針刺組大鼠缺血區(qū)周圍腦組織中BDNF、p75NTR蛋白條帶明顯增強(P<0.01);與模型對照組比較，針刺組大鼠缺血區(qū)周圍腦組織中BDNF蛋白條帶明顯增強，而p75NTR蛋白條帶明顯減弱(P<0.01)。見表3。

表3 Western-blot法檢測各組大鼠腦組織中BDNF、p75NTR蛋白表達水平

2.4 Realtime-PCR法檢測大鼠腦組織中BDNF、p75NTR mRNA 表達

與空白對照組比較，模型對照組及針刺組大鼠缺血區(qū)周圍腦組織中BDNF、p75NTR mRNA 表達水平明顯增加(P<0.01);與模型對照組比較，針刺組大鼠缺血區(qū)周圍腦組織中BDNF mRNA 表達水平明顯增加，而p75NTR mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠缺血區(qū)腦組織中 BDNF、p75NTR mRNA表達水平

3 討論

于氏頭穴叢刺法廣泛地應用于臨床各種腦血管疾病的治療，并取得了令人滿意的治療效果，同時，國內(nèi)學者從不同的角度進行了大量的臨床與實驗研究[8-11]，以闡明其作用機制。本研究擬通過動物實驗研究，探討頭穴叢刺法對MCAO/R模型大鼠缺血區(qū)腦組織中BDNF和p75NTR蛋白與基因表達水平的調(diào)控作用，為臨床缺血性中風的防治提供理論依據(jù)。

BDNF廣泛分布大腦皮層、海馬、下丘腦和小腦等大腦中樞，是腦中含量最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)元生長具有調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究顯示，在腦缺血再灌注所引起的神經(jīng)元損傷中，BDNF對缺血區(qū)周圍受損的神經(jīng)元的修復起到重要作用[12]。腦缺血時p75NTR以低親和力與BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子相互結(jié)合，進一步激活c-Jun和JNK信號轉(zhuǎn)導通路，誘導神經(jīng)元凋亡的發(fā)生[13]。

本研究通過頭穴叢刺的干預手段，觀察其對腦缺血再灌注大鼠腦組織中BDNF、p75NTR基因和蛋白表達的影響。采用免疫組化法對腦組織中BDNF和p75NTR蛋白表達進行檢測。與空白對照組比較，假手術(shù)組大鼠缺血區(qū)周圍腦組織中BDNF蛋白陽性表達水平明顯增加，模型對照組及針刺組又進一步提高(P<0.01);針刺組大鼠缺血區(qū)周圍腦組織中p75NTR蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。采用Western-blot法檢測大鼠腦組織中BDNF、p75NTR蛋白的表達，與其他組別相比較針刺組大鼠缺血區(qū)周圍腦組織中BDNF蛋白條帶明顯增強(P<0.01);針刺組大鼠缺血區(qū)周圍腦組織中p75NTR蛋白條帶則顯示減弱(P<0.01)。采用Realtime-PCR法檢測大鼠腦組織中BDNF、p75NTR mRNA表達，針刺組大鼠缺血區(qū)周圍腦組織中BDNF表達水平較其他組別明顯增加(P<0.01);而p75NTR mRNA表達水平則明顯降低(P<0.01)。以上結(jié)果表明，頭穴叢刺法能顯著增加缺血區(qū)腦組織中BDNF蛋白和基因表達，對受損的神經(jīng)元起到保護的作用；同時還可通過降低p75NTR蛋白和基因的表達，使BDNF與p75NTR的結(jié)合數(shù)量明顯減少，進而阻斷了由于c-Jun和JNK信號通路的激活所產(chǎn)生的一系列級聯(lián)反應，從而抑制神經(jīng)元細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展。實驗結(jié)果為該治療方法在臨床上的推廣及應用提供了實證。

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