大鼠不同心肌狀態(tài)時相關(guān)經(jīng)穴與非穴皮膚血流灌注量的變化特征*

游 敏,程 凱,嵇 波,吳嬌娟,王 丹,白紅新,嚴(yán)明娜,孫曉敏,戴 健,路雅雯,劉翼天,葛云鵬,蘇 杭

(北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

中醫(yī)經(jīng)絡(luò)學(xué)說認(rèn)為人體體表之間、體表/穴位與內(nèi)臟之間存在特定的聯(lián)系，其中體表/經(jīng)穴與臟腑之間相關(guān)一直是研究者們關(guān)注、研究的熱點(diǎn)。近年來不少學(xué)者[1-4]通過各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)以及臨床研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)生理或病理變化時，相關(guān)穴位從靜息態(tài)轉(zhuǎn)化成敏化態(tài)，并隨機(jī)體臟腑功能狀態(tài)的變化而呈現(xiàn)相應(yīng)的不同改變。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為心為君主之官，是五臟六腑之首，不得受邪，而心包為心之外圍，與心關(guān)聯(lián)密切，可“代君受邪”。張景岳在《類經(jīng)》中注解道：“經(jīng)雖分二，藏實(shí)一原。但包絡(luò)在外，為心之衛(wèi)”。手厥陰經(jīng)為心包的同名經(jīng)脈，不論其經(jīng)脈循行還是經(jīng)脈之氣變動后出現(xiàn)的一系列病理變化，均反映了手厥陰經(jīng)與心臟之間的密切聯(lián)系。不少現(xiàn)代研究[5-9]亦發(fā)現(xiàn)當(dāng)心臟發(fā)生病變時，手厥陰經(jīng)穴會出現(xiàn)相應(yīng)的特異性變化，且干預(yù)手厥陰經(jīng)穴可對心臟產(chǎn)生一定的特異性影響。還有學(xué)者[10]結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，對心臟結(jié)構(gòu)、經(jīng)絡(luò)聯(lián)系、生理病理及臨床觀察等方面綜合分析后，認(rèn)為手厥陰經(jīng)與心肌缺血類諸如冠心病、高血壓等疾病具有較強(qiáng)的相關(guān)性。關(guān)于手厥陰經(jīng)“內(nèi)關(guān)穴”對心肌缺血類疾病的影響、作用和機(jī)制等方面，國內(nèi)外學(xué)者做了很多工作，但是關(guān)于心肌處于不同狀態(tài)時，相關(guān)經(jīng)穴特異性反映變化規(guī)律的研究目前尚少。本研究借助激光散斑襯比分析成像(Laser speckle contrast imaging,LSCI)技術(shù)，分別觀測大鼠心肌在生理狀態(tài)時、缺血性損傷病理時和低頻(2 Hz)電針干預(yù)經(jīng)穴或非經(jīng)非穴后，手厥陰經(jīng)“內(nèi)關(guān)穴”和非經(jīng)非穴區(qū)域各自的皮膚血流灌注量，從而探尋相關(guān)經(jīng)穴在機(jī)體處于不同狀態(tài)時隨之相應(yīng)的反映變化規(guī)律。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性Wistar大鼠100只，7周齡，體質(zhì)量200～230 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供[動物合格證號：SCXK(京)2012-0001]。于同等條件下飼養(yǎng)：日光燈照射，12 h明暗交替，室溫保持在(24±1)℃，相對濕度維持在45%左右，清潔級大鼠飼料、自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。本研究中的動物實(shí)驗(yàn)過程，均遵守由美國國立衛(wèi)生院提倡發(fā)起的實(shí)驗(yàn)動物關(guān)懷和使用指導(dǎo)原則(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals,NIH)及以優(yōu)化(Refinement)、 替代(Replacement)、減少(Reduction)為核心的動物實(shí)驗(yàn)“3R”原則。

1.2 試劑與儀器

20%烏拉坦溶液(北京華菁美達(dá)科技有限公司)；注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司)。

小動物呼吸機(jī)(成都泰盟軟件有限公司)；BL-420E+ 科研型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；無菌針灸針(北京華夏藍(lán)籌生物科技有限公司，0.20 mm×13 mm)；PSI-NR 激光散斑血流成像儀(瑞典帕瑞Perimed公司)；7160全自動生化儀(日本日立hitachi公司)；二導(dǎo) HAN’s 穴位刺激儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司)；TX51顯微鏡(日本奧林巴斯Olympus公司)。

2 方法

2.1 分組

7周齡健康雄性Wistar大鼠100只，隨機(jī)均分為1日組和 3 日組，再分為正常組、假手術(shù)組、心肌缺血損傷模型組(以下簡稱模型組)及心肌缺血損傷模型加低頻電針內(nèi)關(guān)組(以下簡稱經(jīng)穴組)、心肌缺血損傷模型加低頻電針非經(jīng)非穴組(以下簡稱非穴組)，每小組各10只。

2.2 模型制備

除正常組和假手術(shù)組外，對其他各組大鼠以改良后的大鼠冠狀動脈左前降支結(jié)扎法[11]建立急性心肌缺血動物模型。麻醉大鼠，記錄術(shù)前大鼠心電圖，備皮，取仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺，經(jīng)口氣管插管后連接小動物呼吸機(jī)。開胸，暴露其心臟，在肺動脈圓錐和左心耳交界下約2 mm處進(jìn)針1～1.5 mm，迅速穿過左冠狀動脈前降支下方將其結(jié)扎(假手術(shù)組只穿線，不進(jìn)行結(jié)扎)，結(jié)扎成功后，迅速排出大鼠胸腔的氣體和液體后縫合，完成關(guān)胸。連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，檢測心電。

模型評價: 心肌結(jié)扎部位周圍組織顏色發(fā)白、發(fā)紺，且心電圖J點(diǎn)抬高，初步證明造模成功。剔除術(shù)前心電圖已出現(xiàn)異常、術(shù)中死亡或造模未成功的大鼠。

術(shù)后護(hù)理：造模后于每只大鼠頸部皮下注射青霉素40萬單位/次，1次/天，預(yù)防感染，并保持大鼠麻醉醒來前于左側(cè)臥位，注意保暖，及時吸痰，密切觀察大鼠情況。

2.3 取穴

參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]大鼠穴位標(biāo)準(zhǔn)定位，同時比照大鼠的形態(tài)解剖、生理特點(diǎn)進(jìn)行取穴定位。

左側(cè)內(nèi)關(guān)穴：大鼠左前肢內(nèi)側(cè)面，距腕關(guān)節(jié)約3 mm的尺橈骨縫間。

雙側(cè)非經(jīng)非穴點(diǎn)：大鼠后肢髖關(guān)節(jié)后上緣外5 mm左右(約環(huán)跳穴外5 mm)。

2.4 各組處理方法

①正常組:在每次經(jīng)穴組和非穴組進(jìn)行電針處理時，行抓取、捆綁固定1次，以保證處理?xiàng)l件相同，在常規(guī)飼養(yǎng)條件下不做其他處理。②假手術(shù)組:開胸后只穿線，不進(jìn)行結(jié)扎，其他各項(xiàng)操作同正常組。③模型組:穿線結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支，造成急性心肌缺血損傷動物模型，其余同正常組。④低頻電針經(jīng)穴組:用毫針直刺其左側(cè)“內(nèi)關(guān)穴”約2 mm，同時在左側(cè)“內(nèi)關(guān)穴”外上方約5 mm非穴處平刺入皮下約1 mm，連接電針儀，正極接“非穴”針柄，負(fù)極接“內(nèi)關(guān)穴”針柄，施以疏密波，頻率2 Hz，以肢體微微顫動為度，20 min/次。于大鼠結(jié)扎造模成功后，第2天開始進(jìn)行干預(yù)，每日行電針處理1次，1日組處理1次，3日組連續(xù)處理3天。⑤低頻電針非穴組：造模成功后第2天開始電針干預(yù)，用毫針直刺雙側(cè)“非經(jīng)非穴”約2 mm，連接電針儀，其余各項(xiàng)均同低頻電針經(jīng)穴組。

2.5 檢測和統(tǒng)計(jì)方法

2.5.1 皮膚血流灌注量 儀器設(shè)置：實(shí)驗(yàn)環(huán)境：工作環(huán)境溫度控制在15℃～30℃，相對濕度維持在 10%～80% ，大氣壓約70～160 kPa。參數(shù)設(shè)置：使用瑞典帕瑞公司生產(chǎn)的PSI-NR 激光散斑血流成像儀，采樣頻率設(shè)置為5幀圖像/s，有效采樣頻率為1幀圖像/s，平均化記錄5，掃描頭距被測大鼠約20～25 cm，掃描范圍為背面5 cm×5 cm、腹面3 cm×14 cm。

實(shí)驗(yàn)步驟：檢測時機(jī)：1日組于1次電針干預(yù)后、3日組于第3次電針干預(yù)后，即刻觀測各組各檢測區(qū)的皮膚血流灌注量。檢測準(zhǔn)備：在測試前24 h脫毛處理大鼠待測部位，并用清水完全洗凈脫毛劑,保持室內(nèi)無日光直射，無明顯空氣對流，無強(qiáng)紅外輻射存在，溫度(24±1)℃，相對濕度 55%±5%,將大鼠麻醉后固定于臺架上，置于電熱板上保溫待測。檢測：分別對經(jīng)穴和非經(jīng)非穴區(qū)域進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測(持續(xù)監(jiān)測1 min)，完成采樣，將數(shù)據(jù)存盤。注意事項(xiàng)：需盡量保持大鼠相對安靜，測試時若大鼠出現(xiàn)肢體抽動等情況，在數(shù)據(jù)處理時，避免選擇該部分。

數(shù)據(jù)測量與計(jì)算：用PIMSoft 血流儀成像處理軟件記錄各組檢測區(qū)域血流圖，進(jìn)行分析。打開各組各檢測區(qū)域血流圖像，用圓形選擇工具在穴區(qū)選擇測量1.5～2.5 mm2面積內(nèi)的血流灌注量，系統(tǒng)自動生成所選區(qū)域內(nèi)的平均血流灌注量，見圖1和封三彩圖2。

圖1 血流灌注量曲線圖(以正常組內(nèi)關(guān)穴區(qū)為例)

2.5.2 心肌組織HE染色 于所有檢測完成后取出大鼠心臟，置于生理鹽水，讓其自行收縮排血10 min左右，輕壓以排盡余血，生理鹽水反復(fù)多次沖洗后于4%多聚甲醛液中固定保存。將固定好的標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)處理后于光鏡下觀察其形態(tài)。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心肌細(xì)胞 HE 染色結(jié)果

由封三彩圖3可見，正常組大鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)則，整齊緊密，大小均一，核居中，胞質(zhì)著色均勻，細(xì)胞膜完整，未見明顯的炎性細(xì)胞；與正常組相比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞明顯腫脹，核碎裂甚至消失，間質(zhì)水腫，有大量炎細(xì)胞，膜結(jié)構(gòu)較為模糊；與模型組比較，經(jīng)穴組大鼠心肌細(xì)胞開始恢復(fù)規(guī)則、緊密的排序，膜結(jié)構(gòu)較為分明，細(xì)胞核居中，炎性細(xì)胞數(shù)量減少，在缺血壞死區(qū)內(nèi)開始出現(xiàn)部分增生細(xì)胞，呈長梭形且開始與周圍心肌組織細(xì)胞相延續(xù)。與模型組比較，非穴組大鼠心肌細(xì)胞仍然排列紊亂，胞質(zhì)不規(guī)則，間質(zhì)水腫，有大量中性粒細(xì)胞，膜結(jié)構(gòu)模糊。

3.2 各組大鼠內(nèi)關(guān)穴與非經(jīng)非穴區(qū)域皮膚血流灌注量

見表1、圖4～5。

表1 各組大鼠經(jīng)穴與非經(jīng)非穴區(qū)域皮膚血流灌注量

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.01

圖4 1日組內(nèi)關(guān)或非經(jīng)非穴區(qū)皮膚血流灌注量的平均值變化注：與正常組比較，**P<0.01;與模型組比較，▲▲P<0.01

圖5 3日組內(nèi)關(guān)或非經(jīng)非穴區(qū)皮膚血流灌注量的平均值變化注：與正常組比較，**P<0.01;與模型組比較，▲▲P<0.01

3.2.1 內(nèi)關(guān)穴區(qū) 1日組：與正常組相比較，模型組“內(nèi)關(guān)”穴區(qū)血流顯著減少(P<0.01);與模型組比較，低頻電針干預(yù)“內(nèi)關(guān)”穴后“內(nèi)關(guān)”穴區(qū)血流明顯升高(P<0.01)；低頻電針干預(yù)“非經(jīng)非穴”后，“內(nèi)關(guān)”穴區(qū)血流無顯著變化(P>0.05)。3日組：與正常組相比較，模型組“內(nèi)關(guān)”穴區(qū)血流顯著減少(P<0.01);與模型組比較，低頻電針干預(yù)“內(nèi)關(guān)”穴后“內(nèi)關(guān)”穴區(qū)血流明顯增加(P<0.01)，基本接近正常組；低頻電針干預(yù)“非經(jīng)非穴”后，“內(nèi)關(guān)”穴區(qū)血流無顯著變化(P>0.05)。

3.2.2 非經(jīng)非穴區(qū) 1日組：各組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。3日組：與正常組相比，模型組“非經(jīng)非穴”區(qū)血流明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，低頻電針干預(yù)“內(nèi)關(guān)”穴后，“非經(jīng)非穴”區(qū)血流無明顯變化(P>0.05)；低頻電針干預(yù)“非經(jīng)非穴”后，“非經(jīng)非穴”區(qū)血流顯著上升(P<0.01)，與正常組無明顯差異。

4 討論

現(xiàn)有研究已經(jīng)初步證實(shí)了經(jīng)穴具有特異性，在生理狀態(tài)下，經(jīng)穴與非穴間在溫度、血流量、電阻等方面存在一定差異；當(dāng)內(nèi)臟出現(xiàn)病理變化時，相關(guān)經(jīng)穴會隨之出現(xiàn)一些特異性反映；在病理狀態(tài)下針刺干預(yù)相關(guān)經(jīng)穴對機(jī)體的機(jī)能狀態(tài)具有一定的調(diào)節(jié)作用[13]。

微循環(huán)，即組織器官內(nèi)小血管(<150 μm)之間的循環(huán)系統(tǒng)，血液與組織細(xì)胞在此進(jìn)行物質(zhì)交換，其主要作用在于保證機(jī)體各組織器官的血液灌流量與其代謝水平相適應(yīng)，并可調(diào)節(jié)回心血量。微循環(huán)狀態(tài)與機(jī)體生命活動息息相關(guān)，如果微循環(huán)發(fā)生障礙，將會直接影響各組織器官的正常生理功能[14]。血流灌注量可以反映機(jī)體整體的血液分布情況，是評估高血壓、心血管疾病等的重要參數(shù)之一。皮膚是人體最大的器官之一，皮膚血流灌注量與機(jī)體狀態(tài)密切相關(guān)，可反映臟腑血液循環(huán)情況，當(dāng)機(jī)體血容量下降時，可能會引起皮膚血流灌注量隨之減少[15-16]。腧穴是機(jī)體臟腑、經(jīng)絡(luò)之氣輸注于體表的部位，與臟腑、經(jīng)絡(luò)之氣相互貫通，并隨之運(yùn)動、變化。組織學(xué)研究顯示, 相對非穴而言，腧穴處存在更為密集的微血管網(wǎng)絡(luò)[17]，且經(jīng)脈循行線上的血管網(wǎng)呈縱向循經(jīng)排列[18]。有研究[19-21]亦發(fā)現(xiàn)，沿經(jīng)脈循行線的皮膚及皮下深部組織中的微循環(huán)血流灌注量，均高于兩側(cè)的非經(jīng)對照部位。激光散斑成像(Laser speckle imaging,LSI)技術(shù)可以實(shí)時獲取表層血管微米級的高分辨率圖像，是目前研究皮膚微血管的主要技術(shù)，廣泛應(yīng)用于血管結(jié)構(gòu)、功能等檢測[22]。本研究中利用激光散斑襯比分析成像(LSCI)技術(shù)觀測大鼠“內(nèi)關(guān)穴”區(qū)與“非經(jīng)非穴”區(qū)血流灌注量，發(fā)現(xiàn)不論大鼠心肌處于生理狀態(tài)、缺血性損傷病理態(tài)還是低頻(2 Hz)電針干預(yù)經(jīng)穴或非經(jīng)非穴后， “內(nèi)關(guān)穴”區(qū)的皮膚血流灌注量始終高于“非經(jīng)非穴”區(qū)，與現(xiàn)有研究結(jié)果一致。

心臟內(nèi)交感神經(jīng)纖維為主導(dǎo)，分布廣泛。皮膚血流灌注量也受交感神經(jīng)的調(diào)控，其中交感縮血管神經(jīng)對皮膚血管的縮血管神經(jīng)支配最為豐富[23-25]。在正常情況下，心內(nèi)交感神經(jīng)與迷走神經(jīng)共同維持正常的心臟功能及節(jié)律。當(dāng)心肌組織僅輕度受損時，心血管系統(tǒng)可依靠機(jī)體的神經(jīng)、體液等多種機(jī)制進(jìn)行自我調(diào)節(jié)修復(fù)；但當(dāng)心肌組織嚴(yán)重受損以致于自我調(diào)節(jié)不足以維持其正常功能，將導(dǎo)致不同程度的心肌缺血。心肌局部缺血會造成缺血局部的組織細(xì)胞缺氧、缺血，產(chǎn)生一系列病理變化[26]。當(dāng)急性心肌缺血時交感神經(jīng)去甲腎上腺素能血管收縮系統(tǒng)興奮性增強(qiáng)[27]，引起心肌收縮增強(qiáng)、能量消耗嚴(yán)重，釋放去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)、神經(jīng)肽 Y 等遞質(zhì)，這些遞質(zhì)會減少皮膚血流灌注量[28]。本研究在造模成功后，分別于造模后1日、3日監(jiān)測大鼠體表“內(nèi)關(guān)穴”區(qū)與“非經(jīng)非穴”區(qū)的血流灌注量，結(jié)果顯示大鼠處于心肌缺血損傷狀態(tài)時，1日或3日組內(nèi)關(guān)穴區(qū)血流灌注量均較正常大鼠顯著降低，1日模型組非經(jīng)非穴區(qū)域血流灌注無明顯變化，而3日模型組非經(jīng)非穴區(qū)血流灌注量較正常組也有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見心肌處于缺血損傷態(tài)時，雖然機(jī)體皮膚血流灌注量整體呈下降趨勢，但是相對于非經(jīng)非穴而言，相關(guān)經(jīng)穴出現(xiàn)的變化更早、更明顯。

研究發(fā)現(xiàn)[29]低頻電針(1～5 Hz)可降低交感神經(jīng)的興奮性，從而調(diào)節(jié)心功能。張?zhí)飳幍萚30]發(fā)現(xiàn)低頻電針(2 Hz)心經(jīng)上的“神門(HT7)-通里(HT5)”經(jīng)脈段可有效逆轉(zhuǎn)急性心肌缺血大鼠心電圖和血流動力學(xué)指標(biāo)(HR、MAP、RPP)的異常變化。本研究中行低頻電針(2 Hz)干預(yù)后，經(jīng)穴組大鼠的“內(nèi)關(guān)穴”區(qū)血流灌注量較模型組顯著上升，與正常組無明顯差異；經(jīng)穴組大鼠的“非經(jīng)非穴”區(qū)血流灌注量較模型組無明顯變化。而3日經(jīng)穴組HE染色顯示心肌細(xì)胞有所恢復(fù)。非穴組大鼠“內(nèi)關(guān)穴”區(qū)血流灌注量與模型組無明顯差異；非穴組大鼠的“非經(jīng)非穴”區(qū)域血流灌注量，1日組各組間無明顯變化，3日組較模型組有所升高，基本接近于正常組。但是從HE染色結(jié)果來看，3日非穴組心肌細(xì)胞未出現(xiàn)明顯改善的情況?？梢?，當(dāng)機(jī)體處于心肌損傷的病理狀態(tài)時，內(nèi)關(guān)穴區(qū)血流灌注量較正常顯著降低，當(dāng)?shù)皖l電針干預(yù)后機(jī)體心肌損傷狀態(tài)有所恢復(fù)時，內(nèi)關(guān)穴區(qū)血流灌注量升高甚至接近于正常水平，而非經(jīng)非穴區(qū)血流灌注量的高低與心肌狀態(tài)的好壞并不一致。在同等條件下，低頻電針刺激內(nèi)關(guān)穴、非經(jīng)非穴的反映不同，可見以低頻電針刺激穴區(qū)，可能會對針刺部位的局部血流灌注量產(chǎn)生一定的影響，但是局部的血流灌注量變化未必能正確反映當(dāng)下的機(jī)能狀態(tài)；而相對于非經(jīng)非穴而言，相關(guān)經(jīng)穴局部血流灌注量更能準(zhǔn)確反映心肌功能的情況。

本研究結(jié)果提示，相對于非經(jīng)非穴而言，心包經(jīng)“內(nèi)關(guān)穴”區(qū)皮膚血流灌注量能夠即時并特征性地反映當(dāng)下心肌狀態(tài)及其變化情況。當(dāng)心肌處在生理狀態(tài)的時候，“內(nèi)關(guān)穴”區(qū)的皮膚血流灌注量高于“非經(jīng)非穴”區(qū)；當(dāng)心肌呈缺血性病理損傷時，“內(nèi)關(guān)穴”區(qū)皮膚血流灌注量隨之降低；低頻電針刺激內(nèi)關(guān)穴對心肌缺血有一定改善作用，并且這種改善作用可以通過內(nèi)關(guān)穴區(qū)血流灌注量升高反映出來。

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