HBsAg/Anti-HBs共陽性乙型肝炎肝硬化患者HBV表面蛋白免疫逃逸的變異分析

劉佳梁，唐子淋，李樂，張凱，邵金曼，紀冬，李進，徐東平，劉妍，陳國鳳

乙型病毒性肝炎嚴重威脅人類健康，世界衛(wèi)生組織2017年最新發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示在全球范圍內(nèi)約有2.57億人患有慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染[1]，僅我國就有約9300萬HBsAg陽性攜帶者[2]。HBV血清學標志物5項(HBsAg、Anti-HBs、HBeAg、Anti-HBe以及Anti-HBc)是目前臨床應用最為廣泛的HBV感染檢測與篩查指標。其中，HBsAg陽性通常提示HBV感染，Anti-HBs則被認為是人體應對HBV感染所產(chǎn)生的對抗HBsAg的保護性抗體[3]。傳統(tǒng)的免疫學理論認為Anti-HBs的出現(xiàn)代表機體對HBV的抵抗與免疫，HBsAg與Anti-HBs不會長時間同時存在，然而在實際臨床工作中卻時常見到HBsAg與Anti-HBs共同陽性的情況[4]，這種現(xiàn)象在HBV感染患者中的發(fā)生率在不同地區(qū)不盡相同，我國相關研究報道的發(fā)生率為2.48%～22.65%[5-7]。有研究提示HBsAg與Anti-HBs共同陽性可能與乙型肝炎的疾病嚴重程度，甚至HCC的發(fā)生有關[8-9]，但是在乙型肝炎肝硬化這一特定階段內(nèi)HBsAg與Anti-HBs共同陽性的意義與成因卻并不明確，本研究旨在通過探索上述問題，為臨床實踐及進一步相關研究提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2007年8月－2015年12月于解放軍302醫(yī)院就診并進行HBV DNA定量檢測的5334例HBsAg(+)患者的相關病歷資料，其中376例為HBsAg/Anti-HBs共同陽性。HBsAg/Anti-HBs共同陽性組(以下簡稱共同陽性組)納入標準：①間隔不少于6個月連續(xù)2次檢測確認HBsAg(+)且同時Anti-HBs(+)；②無丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)重疊感染；③腹部超聲、CT、MRI等影像學檢查或肝臟組織病理學檢查明確診斷為肝硬化且未提示原發(fā)性肝癌。共81例患者符合上述納入標準，同時依照上述標準抽取167例HBsAg(+)且Anti-HBs(–)的乙型肝炎肝硬化病例為HBsAg單陽性組(以下簡稱單陽性組)。乙型肝炎肝硬化診斷依據(jù)為我國《慢性乙型肝炎防治指南(2015年)》[10]。納入研究的248例患者均簽署相關知情同意書，本研究經(jīng)解放軍302醫(yī)院倫理委員會審查批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 HBV血清學標志物及HBV DNA定量檢測HBV血清學標志物(包括HBsAg、Anti-HBs、HBeAg、Anti-HBe、Anti-HBc)由解放軍302醫(yī)院臨床檢驗中心采用化學發(fā)光法定性檢測。HBV DNA定量檢測采用羅氏公司商品試劑盒進行檢測，檢測下限為100IU/ml。

1.2.2 HBV DNA S區(qū)序列測定 采用DNA out試劑盒提取血清HBV DNA，嚴格按照說明書進行操作。采用本課題組自主研發(fā)的一管式巢式聚合酶鏈反應(PCR)法擴增HBV S基因技術(國家發(fā)明專利：ZL 200910092331.1，HBV DNA序列測定的下限約為20IU/ml)。所用試劑、引物及具體實驗方法參見本課題組既往報道[11]，PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，送北京天一輝遠生物科技有限公司進行DNA序列測定，每個樣品均進行正反雙向測序，并進行基因測序分析。

1.2.3 HBV基因型、S蛋白主要親水區(qū)免疫逃逸相關變異與新增N-糖基化位點變異分析 將測序所得HBV DNA序列與NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpagex.cgi) 收錄的HBV基因型全基因組標準序列的S基因相比較以檢測HBV基因型。使用DNASTAR Lasergene MegAlign軟件將上述數(shù)據(jù)庫中4條HBV C基因型序列(序列號：AB014381、AB048704、AB074755、AF182804)作為標準與測序所得序列進行比對以分析S區(qū)變異，進而得出S蛋白氨基酸變異情況。主要親水區(qū)(major hydrophilic region，MHR)指S蛋白第99－169位氨基酸，新增N-糖基化位點變異指在原有s146-148NCT N-糖基化位點基礎上，新增NXT/S(X為P以外的任何氨基酸殘基)N-糖基化位點。本研究重點分析既往文獻[12-16]報道過的46種HBV S基因MHR區(qū)免疫逃逸相關位點的變異(表1)。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0及Microsoft Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)[M(Min，Max)]表示，正態(tài)分布的計量資料以±s表示；計數(shù)資料以例數(shù)及百分比表示?？紤]本研究檢測方法檢測下限約為20IU/ml，故樣本HBV DNA檢測結果低于檢測下限(100IU/ml)均按照中間值60IU/ml計，即1.78 log10IU/ml。PT延長時間為實際測得PT時間減去14.0s。依據(jù)數(shù)據(jù)類型分別采用χ2檢驗、t檢驗或U檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 既往報道的HBV S蛋白MHR區(qū)免疫逃逸相關變異Tab.1 Immune escape related mutations within MHR of HBV S protein in previous reports

2 結 果

2.1 兩組乙型肝炎肝硬化患者一般臨床特征分析HBsAg/Anti-HBs共同陽性組81例患者年齡46.8±9.4歲，其中70例(86.4%)為男性，而HBsAg單陽性組167例患者年齡47.8±10.2歲，其中152例(91.0%)為男性。共同陽性組定量檢測HBV DNA數(shù)為5.07±1.86 log10IU/ml，單陽性組HBV DNA數(shù)為5.04±2.07 log10IU/ml，兩組間差異無統(tǒng)計學意義。HBV測序結果與標準序列比照結果顯示共同陽性組與單陽性組HBV基因型均為C型。共同陽性組HBeAg陽性率為50.6%，單陽性組為50.9%，兩組間差異無統(tǒng)計學意義。共同陽性組與單陽性組在年齡、性別構成、丙氨酸轉氨酶(ALT)，總膽紅素(TBIL)、白蛋白(ALB)等生化指標、PT延長時間、HBV DNA水平和HBeAg陽性率上均差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 兩組乙型肝炎肝硬化患者一般臨床特征情況Tab.2 General clinical characteristics of two groups of patients with hepatitis B related liver cirrhosis patients

2.2 兩組乙型肝炎肝硬化患者中HBeAg陽性/陰性與HBV DNA水平分析 共同陽性組中HBeAg(+)患者(50.6%，41/81)的HBV DNA值為5.46±1.99 log10IU/ml，HBeAg(–)患者HBV DNA值為4.65±1.68 log10IU/ml，共同陽性組內(nèi)兩類患者間HBV DNA水平差異無統(tǒng)計學意義。單陽性組中HBeAg(+)患者(50.9%，85/167)的HBV DNA值明顯高于HBeAg(–)患者HBV DNA值(P＜0.001，表3)。

表3 HBeAg陽性/陰性兩組患者HBV DNA水平分析(log10IU/ml, ±s)Tab.3 Analysis of HBV DNA level in two groups of patients with or without HBeAg (log10IU/ml, ±s)

表3 HBeAg陽性/陰性兩組患者HBV DNA水平分析(log10IU/ml, ±s)Tab.3 Analysis of HBV DNA level in two groups of patients with or without HBeAg (log10IU/ml, ±s)

Group HBeAg (+)HBeAg (-)P value Co-existence group (n=81)5.46±1.994.67±1.64 0.06 Single positive group (n=167)5.65±2.044.39±1.90 ＜0.001

2.3 兩組乙型肝炎肝硬化患者HBV S蛋白MHR內(nèi)免疫逃逸相關變異分析 兩組患者共檢出20種MHR內(nèi)免疫逃逸相關變異(表4)，共同陽性組中有38例(46.9%)檢出MHR變異，其中17例(21.0%)可發(fā)現(xiàn)2種或2種以上的多位點聯(lián)合變異，而在單陽性組有42例(25.2%)檢出MHR變異，其中僅12例(7.2%)為多位點聯(lián)合變異(表5)。sL110I/S、sT113N/S、sI/T126A/N/S這3個單位點變異在共同陽性組的檢出率明顯高于單陽性組(P＜0.05)。共同陽性組總體變異檢出率和多位點聯(lián)合免疫逃逸相關變異檢出率均明顯高于單陽性組(P＜0.05，46.9% vs. 25.2%，21.0% vs. 7.2%)。

2.4 兩組患者HBV S蛋白MHR內(nèi)新增N-糖基化位點變異分析 共同陽性組81例患者中，共8例(9.9%，8/81)HBV S蛋白MHR內(nèi)發(fā)生新增N-糖基化位點變異，其中s113-115 TST?NTT 2例、s116-118 TST?NST 1例、s131-133 TSM?NST 5例；單陽性組167例患者中僅2例(1.2%，2/167)MHR內(nèi)發(fā)生新增N-糖基化位點變異，其中s116-118 TST?NST 1例、s131-133 TSM?NST 1例，共同陽性組MHR內(nèi)新增N-糖基化位點變異檢出率明顯高于單陽性組(P=0.007，9.9% vs. 1.2%，表6)。

表4 兩組患者MHR內(nèi)免疫逃逸相關位點變異分析 (%)Tab.4 Analysis of immune escape related mutants in MHR of two groups of patients (%)

表5 兩組患者MHR內(nèi)免疫逃逸相關多位點聯(lián)合變異情況Tab.5 Multi-immune escape related mutations in MHR of two groups of patients

表6 兩組患者MHR內(nèi)新增N-糖基化位點變異分析Tab.6 Analysis of additional N-glycosylation mutations in MHR of two groups of patients

3 討 論

HBsAg/Anti-HBs共同陽性是HBV感染后乙肝血清學標志物檢測結果中的一種特殊模式，在本研究納入的81例HBsAg/Anti-HBs共同陽性與167例HBsAg單陽性乙型肝炎肝硬化患者的性別、年齡構成以及ALT、TBIL、ALB等生化指標、PT延長時間、HBV DNA載量和HBeAg陽性率上均未見明顯差異，提示在已經(jīng)進展至肝硬化的乙型肝炎患者中，HBsAg/Anti-HBs共同陽性并不能提示病情嚴重程度的不同。

值得注意的是，HBeAg在臨床工作中常用于評估HBV復制的活躍程度，HBeAg(+)多意味著患者體內(nèi)HBV復制相對活躍，且在抗病毒治療過程中HBeAg轉陰也常被認為是病情好轉的標志之一，也是判斷抗病毒藥物停藥時機常用的參考指標[10]，在本研究167例單陽性患者中，HBeAg(–)患者的總體HBV DNA水平低于HBeAg(+)患者，這與臨床實際情況相符。但在共同陽性組內(nèi)HBeAg(–)與HBeAg(+)患者的HBV DNA水平并無明顯差異，說明HBeAg這一指標在HBsAg/Anti-HBs共同陽性乙型肝炎肝硬化患者中反映HBV復制的能力相對較弱，提示臨床醫(yī)生在面對此類患者時要更加慎重地依靠HBeAg去判斷病情和制定診療計劃。

共同陽性組與單陽性組之間的HBV DNA總體水平未見明顯差異，提示在乙型肝炎肝硬化的共同陽性患者中，Anti-HBs并不能有效地抵抗HBV感染以及中和HBsAg。HBsAg共226個氨基酸(aa)，可分為N-端(aa 1-98)、MHR(aa 99-169)和C-端(aa 170-226)，其中MHR的第124–147位氨基酸殘基又被稱為“α”決定簇，是中和抗體的主要結合靶位。已有研究表明S蛋白變異可致免疫逃逸發(fā)生，導致HBsAg與Anti-HBs共同陽性[17-19]。在本課題組既往研究以及查閱的文獻中共報道了46種MHR內(nèi)免疫逃逸相關變異，本研究共同陽性組內(nèi)上述免疫逃逸相關變異的檢出率以及同時有2種或2種以上的多位點聯(lián)合變異檢出率均明顯高于單陽性組。其中sL110I/S、sT113N/S、sI/T126A/N/S這3種變異在共同陽性組的發(fā)生率較單陽性組明顯升高，提示這3個位點以及多位點聯(lián)合變異可能是導致共同陽性現(xiàn)象出現(xiàn)的主要原因之一。

N-糖基化是蛋白翻譯后的一種特殊修飾方式，影響蛋白質(zhì)空間構象，調(diào)節(jié)蛋白抗原性，過度糖基化有可能導致蛋白抗原表位被掩蓋，從而造成病毒的免疫逃逸。在HBV原有s146-148NCT之外的其他位點上出現(xiàn)NXT/S(X不為P)形式的氨基酸殘基組合，即新增N-糖基化位點變異。Yu等[20]的研究表明MHR內(nèi)新增N-糖基化變異是造成HBV免疫逃逸的主要原因之一。本課題組前期實驗也證實MHR內(nèi)新增N-糖基化變異能夠使HBV抗原性改變，導致Anti-HBs與HBsAg結合能力下降[11]。本研究分析結果顯示，在已進展至肝硬化的HBsAg/Anti-HBs共同陽性乙型肝炎患者中MHR內(nèi)新增N-糖基化位點變異檢出率同樣明顯高于HBsAg單陽性患者，提示在已進展至肝硬化階段的乙型肝炎患者同樣存在因MHR內(nèi)新增N-糖基化位點變異所致的HBV免疫逃逸可能。Yu等[20]研究中HBsAg/Anti-HBs共同陽性組患者新增N-糖基化變異檢出率高達21.8%，遠高于本研究9.9%的檢出率，此差異可能是由于本研究所納入研究對象均為已明確進展至乙型肝炎肝硬化的患者，而Yu等[20]的研究人群則包含慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及乙肝相關原發(fā)性肝細胞癌的患者。

因本研究為回顧性研究，所以臨床資料中腹水量、血肌酐水平等指標難以全部獲得，故不能使用Child-Pugh、MELD等臨床評估肝硬化患者嚴重程度常用的評分系統(tǒng)進行進一步量化分析。本研究所納入患者均為核苷(酸)類似物經(jīng)治的肝硬化患者，所以更加接近臨床實踐中多數(shù)肝硬化患者病史較長且經(jīng)歷過一種甚至多種抗病毒治療的實際情況，這樣所得出的結論更能夠反映真實世界的現(xiàn)實情況，但另一方面，在分析HBV變異過程中也可能存在藥物因素所致的干擾，這也是本研究的局限之一。

總之，已明確進展至肝硬化的HBsAg/Anti-HBs共同陽性患者的一般臨床表現(xiàn)與HBsAg單陽性患者無明顯差異。在HBsAg/Anti-HBs共同陽性乙型肝炎肝硬化患者中，應謹慎評價HBeAg反映HBV復制活躍程度的能力。相較于HBsAg單陽性患者，在已進展至肝硬化的HBsAg/Anti-HBs共同陽性患者中，HBV S蛋白MHR內(nèi)免疫逃逸相關變異檢出率更高、變異形式更加多樣、聯(lián)合變異更加復雜，且新增N-糖基化位點變異的檢出率也明顯升高，這些變異均可能是HBsAg/Anti-HBs共同陽性的驅(qū)動因素之一。當然，乙型病毒性肝炎的總體疾病進展是由HBV自身的活動與宿主免疫系統(tǒng)等多種因素的動態(tài)變化與相互作用所共同決定，本研究僅在HBV病毒學方面進行了一些探索，要全面闡明HBsAg/Anti-HBs共同陽性的機制，仍須更進一步深入研究。

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