乙型肝炎病毒rtA181T耐藥相關(guān)突變引起的sW172終止與非終止突變的臨床發(fā)生特點及表型差異分析

趙麗，李曉東，陳容娟，邵金曼，周怡，思蘭蘭，許智慧，劉妍，徐東平

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題，據(jù)統(tǒng)計，全球大約有2.4億慢性HBV感染者，其中我國有9300萬左右，每年死于HBV相關(guān)疾病的人數(shù)多達(dá)75萬[1-2]。目前核苷(酸)類似物(NAs)是治療HBV感染的主要藥物，主要包括核苷類藥物拉米夫定(LAM)、替比夫定(LDT)、恩替卡韋(ETV)和核苷酸類藥物阿德福韋酯(ADV)、替諾福韋酯(TDF)。ADV是繼LAM之后第2個應(yīng)用于臨床抗HBV治療的NAs藥物。與其他NAs類藥物作用原理相同，ADV通過抑制HBV反轉(zhuǎn)錄酶活性進(jìn)而抑制HBV復(fù)制，但對HBV原始復(fù)制模板cccDNA無直接抑制作用，因此需要長期用藥[3]。ADV的耐藥基因屏障較低，有研究顯示ADV初治患者5年耐藥發(fā)生率為29%[4]。

rtA181T突變的出現(xiàn)與拉米夫定和阿德福韋用藥相關(guān)，并可引起對ADV敏感性的輕微下降，但半數(shù)最大效應(yīng)濃度(EC50)值升高＜2倍，單獨出現(xiàn)不足以引起ADV臨床耐藥[5-6]。大多數(shù)rtA181T突變可引起相應(yīng)sW172終止突變，產(chǎn)生的截短型HBsAg易于積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加了肝細(xì)胞癌的發(fā)生風(fēng)險[7-9]。但少數(shù)rtA181T突變也可引起sW172位點非終止突變，包括sW172S和sW172L兩種。目前對非終止突變的臨床發(fā)生特點和意義及其表型變化的研究十分有限[10]，缺乏基于大樣本研究的數(shù)據(jù)。針對上述問題，本研究分析大樣本慢性乙型肝炎患者中rtA181T突變引起S區(qū)終止型和非終止型HBsAg的臨床發(fā)生特點，并比較兩者在聯(lián)合原發(fā)ADV耐藥突變rtN236T時對HBsAg表達(dá)、病毒復(fù)制力和ADV耐藥性影響的差別，以幫助明確rtA181T/sW172非終止突變發(fā)生的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2011年7月－2016年7月于解放軍302醫(yī)院就診的12 708例乙型肝炎患者血清樣本的測序檢測結(jié)果。排除HIV、HDV等混合感染者；排除原發(fā)性肝癌患者；排除酒精性肝病及自身免疫性肝病患者；排除原發(fā)性肝癌患者?；颊哐鍢颖颈４嬗讪C20℃，所有常規(guī)臨床指標(biāo)均由該院臨床檢驗中心完成。本研究經(jīng)解放軍302醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 主要試劑 血清中病毒DNA提取采用四川天澤公司DNAout試劑提取盒。PCR試劑盒購自北京全式金公司；pGEM-Teasy載體購自美國Promega公司；Xho Ⅰ/Sph Ⅰ內(nèi)切酶及T4DNA連接酶購自日本TaKaRa公司；pTriEx-HBV 1.1倍載體由法國里昂大學(xué)Zoulim教授惠贈；FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Roche公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。

1.3 方法

1.3.1 臨床和實驗室檢查 收集每例患者接受NAs治療前后的臨床和實驗室數(shù)據(jù)，包括人口統(tǒng)計資料、NAs治療史、血清HBV DNA水平和生化指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、膽堿酯酶(CHE)等。

1.3.2 HBV RT區(qū)基因突變分析及基因型分析 采用病毒DNA提取試劑提取患者血清中的HBV DNA，應(yīng)用本課題組建立的超靈敏巢式PCR方法擴(kuò)增HBV RT基因(國家發(fā)明專利ZL200910092331.1)[11]。送PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，對rt80、rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt214、rt236和rt250等經(jīng)典和潛在的LAM、ADV、ETV耐藥相關(guān)位點的序列峰圖進(jìn)行分析。按照文獻(xiàn)[12]中的方法進(jìn)行HBV基因分型。

1.3.3 基因克隆 將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-Teasy載體，然后隨機(jī)挑選≥20個克隆進(jìn)行DNA測序并分析耐藥相關(guān)突變。

1.4 1.1倍pTriEx-HBV重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 提取rtA181T/sW172S+N236T、rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172stop+N236T和野生型質(zhì)粒，經(jīng)Xho Ⅰ和Sph Ⅰ雙酶切后將RT區(qū)片段連接至pTriEx–HBV(C)1.1倍載體上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，接種LB培養(yǎng)板(含有100μg/ml氨芐西林)，37℃培養(yǎng)箱過夜，隨機(jī)挑取樣品進(jìn)行克隆測序，鑒定HBV表達(dá)載體構(gòu)建成功后，制備轉(zhuǎn)染級相關(guān)突變株克隆質(zhì)粒備用。

1.5 定點突變 根據(jù)實驗需要，將rtA181T/sW172stop+N236T進(jìn)行定點突變回復(fù)為N236T突變株。根據(jù)原始序列設(shè)計1對正反向引物，引物長度為25～50個堿基。以原突變質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)甲基化酶Dpn Ⅰ處理，選擇性保留突變成功的質(zhì)粒。將消化后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，37℃過夜，挑選2～3個樣品測序驗證，獲得突變成功質(zhì)粒。具體方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 構(gòu)建1.1倍重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測復(fù)制力及HBsAg水平 轉(zhuǎn)染前1d將HepG2細(xì)胞按1×105個/孔置于24孔板中，待細(xì)胞生長至60%～80%融合時，每孔加入0.25μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染4h后，分別加入濃度梯度的ADV(0、3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L)，每2d更換相應(yīng)藥物濃度的新培養(yǎng)液，連續(xù)4d后收集細(xì)胞上清，采用實時熒光定量PCR檢測HBV DNA水平。重復(fù)實驗3次。病毒的復(fù)制力以無藥物壓力下自然產(chǎn)生的HBV DNA水平評價，病毒的藥物敏感性以EC50評價，EC50值越高表明藥物敏感性愈低。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)以±s或M(Q1，Q3)表示，采用方差分析及兩樣本獨立t檢驗進(jìn)行比較。定性資料率及組成比較采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HBV rtA181T突變患者的臨床特點 在12 708例慢性乙型肝炎患者中，有504例(3.96%)患者檢出rtA181T突變，其中男性443例，女性61例，年齡43.0±10.54歲，ALT 47(27～100)U/L，AST 43(27～90)U/L，TBIL 15.20(10.80～25.20)μmol/L，HBV DNA載量4.92±1.86log10IU/ml。根據(jù)rtA181T陽性突變患者的性別匹配相應(yīng)的rtA181T陰性突變患者并對二者進(jìn)行比較，結(jié)果顯示rtA181T陽性突變患者年齡、ALT、CHE、HBV DNA水平顯著高于rtA181T陰性突變患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。rtA181T陽性突變患者基因型分布(C型96.03%，B型3.97%)與rtA181T陰性突變患者(C型81.50%，B型18.50%)比較存在顯著差異(P=0.013)。相對于rtA181T陰性突變患者，rtA181T陽性突變患者接受ADV治療的比例更高(表1)。

2.2 rtA181T突變與其他NAs耐藥突變共存情況直接測序結(jié)果顯示，有504例患者檢出rtA181T突變，其中有270例rtA181T突變單獨出現(xiàn)，44例伴隨恩替卡韋耐藥突變，31例伴隨拉米夫定耐藥突變，13例伴隨多重耐藥突變(即同時出現(xiàn)核苷類與核苷酸類藥物的耐藥突變)。此外有146例伴隨ADV耐藥突變，包括17例rtA181T+A181V、81例rtA181T+N236T，40例rtA181T+A181V+N236T、5例V173L+L180M+A181T+A181V+N236T、2例L180M+A181T+A181V+N236T和1例L180M+A181T+A181V+N236T(表2)。

表1 rtA181T陽性突變與rtA181T陰性突變患者的臨床資料分析Tab.1 Clinical features of the patients with and without rtA181T mutation

2.3 rtA181T突變的測序峰圖結(jié)果 分析504例rtA181T突變病毒測序峰圖出現(xiàn)，其對應(yīng)sW172突變有1種終止突變和2種非終止突變(L、S)，包括409例(81.1%)sW172stop，29例(5.8%)sW172L，15例(3.0%)sW172L和51例(10.1%)sW172終止與非終止突變株共存；突變株可與野生株(wt)共存(圖1)。

2.4 ADV耐藥患者中rtA181T/sW172stop終止突變與rtA181T/sW172非終止突變的臨床特點 表3比較了ADV耐藥患者中單獨出現(xiàn)的rtA181T/sW172stop突變聯(lián)合rtN236T突變與rtA181T/sW172L或sW172S聯(lián)合rtN236T突變患者的臨床資料和實驗室檢測指標(biāo)，結(jié)果顯示，兩組患者在年齡、性別、ALT、AST、CHE等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但前一組患者血清HBV DNA水平明顯低于后一組(3.63log10IU/ml vs. 5.07log10IU/ml，P=0.013)。

2.5 體外實驗突變株HBsAg、HBV DNA水平測定及表型耐藥分析 羅氏定量結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染rtA181T/sW172stop+N236T突變株重組質(zhì)粒后，HepG2細(xì)胞上清中的HBsAg低于檢測下限，而rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172S+N236T突變株重組質(zhì)粒后HBsAg表達(dá)水平僅較野生株輕微降低(圖2A)。病毒復(fù)制力檢測顯示，rtA181T/sW172stop+N236T突變株復(fù)制力水平相對于野生株低于rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172S+N236T突變株(P＜0.05，圖2B)。表型耐藥分析結(jié)果顯示，rtA181T/sW172stop+N236T、rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172S+N236T病毒株與對應(yīng)野生株相比，其對ADV的耐藥倍數(shù)分別為3.69倍、5.49倍、7.38倍。rtA181T/sW172stop+N236T病毒株對ADV的敏感性高于rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172S+N236T病毒株(表4)。

表2 rtA181T突變與其他NAs耐藥突變共存情況Tab.2 The mutants concomitancy of rtA181T mutant and other nucleoside (acid) analogues resistant mutants

圖1 rtA181T突變引起S區(qū)172編碼序列改變的類型Fig.1 Changes of S gene 172 amino acid coding sequence caused by rtA181T mutation

表3 ADV耐藥患者中rtA181T/sW172非終止突變與終止突變的臨床資料比較Tab.3 Clinical features of ADV resistant patients with rtA181T/sW172stop and non-stop mutations

圖2 培養(yǎng)上清中HBsAg定量結(jié)果(A)和突變株復(fù)制力評價(B)Fig.2 Quantitation of HBsAg in supernatant (A) and assessment of viral replication capacity of mutant strain (B)Dashed line represents lower limit of detection for HBsAg (0.05IU/ml). (1)P＜0.05 compared with wild type

表4 ADV對野生型及4種突變型病毒株的EC50比較Tab.4 Phenotypic resistance of wild type and 4 ADV-resistant mutants

3 討 論

以往ADV曾經(jīng)作為臨床一線藥物被廣泛使用，雖然我國2015年的《慢性乙型肝炎防治指南》已將ETV和TDF列為一線臨床抗病毒藥物[13]，但受經(jīng)濟(jì)條件和用藥習(xí)慣等因素的影響，臨床上ADV的應(yīng)用仍占有相當(dāng)比例。常見的ADV原發(fā)耐藥突變有rtN236T和rtA181V[14]，此外還有本課題組前期發(fā)現(xiàn)的rtN236V和rtA181S[15-16]。一般認(rèn)為，當(dāng)突變株對ADV的EC50達(dá)到野生病毒株的2倍以上時可引起耐藥[17]。以往有研究顯示，rtA181T、rtAN236T、和rtA181V突變株對ADV的EC50值分別為野生株的1.2±0.5倍、7.0±4.1倍和4.3±1.2倍[5]。rt181T雖然不是原發(fā)ADV耐藥突變，但與ADV用藥相關(guān)，被認(rèn)為是一種非典型的ADV耐藥相關(guān)突變。大多數(shù)rtA181T突變可導(dǎo)致sW172終止突變，影響HBsAg的表達(dá)和分泌[7]，但以往缺少對rtA181T/sW172非終止突變的認(rèn)識，最近有研究揭示了rtA181T/sW172終止突變與rtA181T/sW172L突變對病毒復(fù)制、HBsAg表達(dá)和分泌具有不同影響[18]，但至今尚未見rtA181T/sW172非終止突變發(fā)生特點的臨床大樣本分析及其聯(lián)合原發(fā)ADV耐藥突變時耐藥性變化的報道。

本研究應(yīng)用直接測序法分析了12 708例慢性HBV感染者的耐藥突變信息，檢出的rtA181T突變患者占3.96%。74.6%的rtA181T突變患者有ADV治療史，表明rtA181T突變與ADV用藥相關(guān)。146例rtA181T突變與ADV耐藥突變共同出現(xiàn)，其中有81例rtA181T與N236T共同出現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，rtA181T/sW172stop+N236T突變株的復(fù)制力顯著低于rtA181T/sW172L+N236T和rtA181T/sW172S+N236T突變株；rtA181T/sW172stop+N236T突變株對ADV的耐藥性與野生株相比提高了3.69倍，而rtA181T/sW172L+N236T和rtA181T/sW172S+N236T對ADV的耐藥性則分別提高了5.49倍和7.83倍。病毒的耐藥性及自然復(fù)制力是決定病毒株在藥物壓力下復(fù)制競爭力強(qiáng)弱的兩個要素，rtA181T/sW172非終止突變株的ADV耐藥性提高應(yīng)與其自然復(fù)制力較高密切相關(guān)，但由于rtA181T/sW172非終止突變株需要同時出現(xiàn)兩種核苷酸突變，限制了其發(fā)生。此外，病毒對機(jī)體免疫反應(yīng)性的適應(yīng)性也可影響病毒的復(fù)制競爭力。rtA181T/sW172終止突變可導(dǎo)致產(chǎn)生截短型HBsAg，引起一個CTL重要表位env335-343(即s172-180)的缺失[19]。HBV從rtA181T/sW172終止突變轉(zhuǎn)變?yōu)閞tA181T/sW172非終止突變時，雖然病毒的復(fù)制力可增加，但可能引起該表位特異性CTL的攻擊。總之，rtA181T/sW172非終止突變的發(fā)生取決于病毒、藥物與機(jī)體免疫三方面的綜合影響，其具體機(jī)制還需要更深入的研究。

本研究證實，在體外實驗中rtA181T/sW172終止突變可導(dǎo)致HBsAg分泌表達(dá)缺陷，而rtA181T/sW172非終止突變對HBsAg分泌表達(dá)的影響較小，但攜帶兩種突變病毒的患者HBsAg水平并無明顯差異，分析原因是大多數(shù)患者體內(nèi)rtA181T突變株與野生株共存，即使未檢出與野生株共存，由于PCR直接測序法只能檢測到20%以上的病毒序列，仍可能與少量野生株共存，提供病毒所需的HBsAg。本研究結(jié)果還表明，rtA181T/sW172終止突變聯(lián)合rtN236T突變株的病毒復(fù)制力明顯低于兩種rtA181T/sW172非終止突變聯(lián)合rtN236T突變株，這與我們觀察到的臨床現(xiàn)象相符，即感染rtA181T/sW172stop+N236T突變病毒的患者HBV DNA水平顯著高于感染rtA181T/sW172L或sW172S+N236T突變病毒的患者(表2)，提示與rtA181T/stop+N236T突變株相比，rtA181T/sW172L+N236T和rtA181T/sW172S+N236T突變株引起的病毒學(xué)反跳水平較高，更應(yīng)引起臨床重視。

總之，本研究通過對大樣本的臨床患者進(jìn)行測序，明確了我國慢性HBV感染患者rtA181T/sW172非終止突變的臨床發(fā)生特點，明確了在聯(lián)合rtN236T突變時，rtA181T/sW172非終止突變可較非終止突變賦予病毒更高的ADV耐藥性，這些發(fā)現(xiàn)加深了對HBV耐藥突變的認(rèn)識，可為臨床合理監(jiān)控耐藥提供幫助。

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