恩替卡韋耐藥的慢性乙型肝炎患者序貫挽救治療的臨床療效與病毒學(xué)演變分析

邵金曼，劉妍，陳容娟，周怡，趙麗，劉佳梁，李樂，許智慧，徐東平

乙型肝炎病毒(HBV)感染嚴(yán)重危害人類健康，持續(xù)病毒復(fù)制增加了肝硬化和肝癌的發(fā)生風(fēng)險，而抗HBV治療是限制或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展的關(guān)鍵[1]。核苷(酸)類似物(NAs)是臨床上最常用的抗HBV藥物，分為核苷類似物和核苷酸類似物，前者包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韋(ETV)和恩曲他濱，后者包括阿德福韋酯(ADV)和替諾福韋酯(TDF)。NAs因能有效抑制病毒復(fù)制、口服方便、價格低廉而在臨床廣泛應(yīng)用[2]，但長期服用產(chǎn)生的耐藥性可導(dǎo)致治療失敗，是困擾臨床的難題[3]。在近20年的臨床實(shí)踐中，我國已積累了相當(dāng)數(shù)量的NAs治療失敗并檢出各種耐藥突變的患者。在2014年TDF被我國批準(zhǔn)用于慢性乙型肝炎(CHB)抗病毒治療之前，ETV耐藥患者的挽救治療方案以ETV+ADV為主，但長期應(yīng)用仍有患者應(yīng)答不佳，此類患者臨床上換用TDF或TDF+ETV挽救治療的病毒學(xué)動態(tài)演變特點(diǎn)少見報道。本研究的目的是分析臨床上NAs治療失敗并檢出ETV耐藥突變的HBV感染患者ETV+ADV聯(lián)合挽救治療應(yīng)答不佳、繼續(xù)TDF±ETV挽救治療期間的臨床療效與病毒學(xué)動態(tài)演變特點(diǎn)，為臨床實(shí)踐提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2003年7月－2006年12月就診于解放軍302醫(yī)院的4例NAs治療失敗并檢出ETV耐藥突變的CHB患者，在接受ETV(0.5mg/d)+ADV(10mg/d)聯(lián)合挽救治療后仍應(yīng)答不佳。4例患者無其他病毒合并感染和其他原因引起的肝病，在接受ETV+ADV聯(lián)合治療應(yīng)答不佳后以TDF(300mg/d)或TDF(300mg/d)+ETV(0.5mg/d)繼續(xù)聯(lián)合挽救治療，并隨訪觀察至2016或2017年。本研究經(jīng)解放軍302醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 主要試劑 病毒DNA-OUT提取試劑盒購自北京天恩澤公司；2×EasyTaq PCR SuperMix及Trans109感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金公司；膠回收試劑盒購自德國Qiagen公司；pGEM-Teasy載體購自美國Promega公司；T4DNA連接酶購自日本TaKaRa公司。引物合成和基因測序由北京天一輝遠(yuǎn)公司完成。

1.3 方法

1.3.1 臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查 收集每例患者接受ETV+ADV及換成TDF或TDF+ETV前后的臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，包括人口統(tǒng)計資料、NAs治療史及治療時間、HBV抗原抗體等血清學(xué)指標(biāo)、血清HBV DNA水平、血生化指標(biāo)包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血清肌酐(Cre)和血磷(P)水平等。

1.3.2 HBV RT區(qū)基因突變分析與基因型分析 使用病毒DNA提取試劑提取患者血清HBV DNA，采用本課題組創(chuàng)新建立的超靈敏巢式PCR方法擴(kuò)增HBV RT基因(國家發(fā)明專利ZL200910092331.1)[4]。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA雙向測序，對rt80、rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt214、rt236和rt250等經(jīng)典和潛在的LAM、ADV、ETV耐藥相關(guān)位點(diǎn)的序列峰圖進(jìn)行分析。按照文獻(xiàn)[5]中的方法進(jìn)行HBV基因分型。

1.3.3 基因克隆 將PCR產(chǎn)物直接克隆至pGEMTeasy載體，隨機(jī)挑選20個克隆進(jìn)行DNA序列測定并分析耐藥相關(guān)變異。

2 結(jié) 果

2.1 患者在挽救治療期間耐藥突變病毒的動態(tài)演變特點(diǎn) 4例患者均為男性，年齡44～56歲，平均49.5歲。其中3例患者(P2，P3，P4)HBeAg陽性，2例患者(P1，P4)ALT水平異常(表1)。

4例患者在ETV+ADV治療之前有至少1種NAs治療失敗史，繼而接受ETV+ADV聯(lián)合挽救治療。在ETV+ADV治療開始時HBV RT區(qū)基因突變分析顯示4例患者均檢出ETV耐藥變異位點(diǎn)(rtM204I/V且同時出現(xiàn)rtT184/rtS202/rtM250這3個位點(diǎn)之一的突變)。HBV RT區(qū)基因型分析顯示所有患者均為C基因型(表1)。為了觀察ETV+ADV聯(lián)合治療開始時HBV病毒株的動態(tài)演變特點(diǎn)，用課題組建立的超靈敏方法(檢測限為20IU/ml，下同)對4例患者不同時間點(diǎn)的血清樣本進(jìn)行基因克隆(≥20個/樣本)分析，結(jié)果顯示P1在ETV+ADV治療開始時克隆結(jié)果為rtL180M+rtT184L+rtM204V占100%，均為ETV耐藥株；P2在ETV+ADV治療開始時克隆結(jié)果為rtL180M+rtT184A+rtM204V占80%和rtL180M+rtT184A+rtM204V+rtV214A占20%，均為ETV耐藥株；P3在ETV+ADV治療開始時克隆結(jié)果為rtV173L+rtL180M+rtM204I+rtM250L占100%，均為ETV耐藥株；P4在ETV+ADV治療開始時克隆結(jié)果為rtL180M+rtT184L+rtM204V占94.4%和WT占5.6%，以ETV耐藥株為主(圖1)。

4例患者均接受了40.5(14～63)個月的ETV+ADV聯(lián)合治療。ETV+ADV聯(lián)合治療后HBV RT區(qū)基因突變分析顯示3例患者有ETV耐藥變異位點(diǎn)，此外1例患者無耐藥變異位點(diǎn)，并且除了HBV經(jīng)典耐藥變異位點(diǎn)還有潛在耐藥變異位點(diǎn)rtV214A。為了觀察ETV+ADV聯(lián)合治療后HBV病毒株的動態(tài)演變特點(diǎn)，對4例患者不同時間點(diǎn)的血清樣本進(jìn)行基因克隆(≥20個/樣本)分析，結(jié)果顯示P1在應(yīng)用ETV+ADV治療47個月后克隆結(jié)果為rtL180M+rtT184L+rtM204V占75%和rtA181S+rtT184L+rtM204I占25%，均為ETV耐藥株；P2在應(yīng)用ETV+ADV治療14個月克隆結(jié)果為rtL180M+rtT184A+rtM204V+rtV214A占57%和rtL180M+rtT184A+rtM204V占43%，均為ETV耐藥株；P3在應(yīng)用ETV+ADV治療51個月后克隆結(jié)果為WT占79%、rtM250L占11%、rtV173L+rtL180M占5%和rtV173L+rtL180M+rtM204I占5%，以WT為主；P4在應(yīng)用ETV+ADV治療26個月克隆結(jié)果均為WT(圖1)。

表1 ETV+ADV聯(lián)合治療前患者基線特征和基因突變形式Tab.1 Baseline characteristics and genotypic mutation patterns of patients prior to combined ETV+ADV therapy (direct PCR sequencing)

圖1 4例患者抗病毒治療期間的臨床特征及HBV耐藥株進(jìn)化特點(diǎn)Fig.1 Evolution of resistant HBV strains with clinical virology and biochemical response features in 4 cases during antiviral treatment

4例患者在接受了40.5(14～63)個月的ETV+ADV聯(lián)合治療后繼續(xù)換用TDF或TDF+ETV治療32.5(23～40)個月，HBV RT區(qū)基因突變分析顯示1例患者有ETV耐藥變異位點(diǎn)，2例患者無耐藥變異位點(diǎn)，此外，1例患者HBV DNA巢式PCR未檢測出。為了觀察TDF或TDF+ETV治療后HBV病毒株的動態(tài)演變特點(diǎn)，對4例患者不同時間點(diǎn)的血清樣本進(jìn)行基因克隆(≥20個/樣本)分析，結(jié)果顯示P1在應(yīng)用TDF治療23個月后克隆結(jié)果全部為WT；P2應(yīng)用TDF+ETV治療38個月后克隆結(jié)果為rtL180M+rtT184A+rtM204V占75%和rtL180M+rtT184A+rtM204V+rtV214A占 25%，均為ETV耐藥株；P3在應(yīng)用TDF治療40個月后克隆結(jié)果全部為WT；P4在應(yīng)用TDF治療17個月后HBV DNA巢式PCR未檢測出(圖1)。

2.2 患者在挽救治療期間的病毒學(xué)、生化學(xué)和血清學(xué)應(yīng)答 NAs用藥過程中的HBV DNA和ALT變化見圖1。4例患者在ETV+ADV聯(lián)合治療前血清HBV DNA為4.28(2.93～7.45)log10IU/ml，在接受了40.5(14～63)個月的ETV＋ADV聯(lián)合治療后HBV DNA下降到2.99(2.36～5.93)log10IU/ml，均未實(shí)現(xiàn)血清HBV DNA檢測不到。在ETV+ADV挽救治療期間，P1在治療4個月后ALT水平恢復(fù)正常，P4在治療7個月后ALT水平恢復(fù)正常，3例患者均未實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，4例患者均未實(shí)現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)。隨后4例患者換用TDF或TDF+ETV繼續(xù)挽救治療32.5(23～40)個月，P1和P3均在3個月后、P2和P4分別在28和17個月后血清HBV DNA檢測不到(血清HBV DNA ＜40IU/ml)，隨訪15(10～37)個月血清HBV DNA持續(xù)檢測不到。4例患者在TDF或TDF+ETV繼續(xù)挽救治療期間，ALT波動并維持正常水平，3例患者均未實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，4例患者均未實(shí)現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)(表2)。

表2 TDF挽救治療期間4例患者的病毒學(xué)、生化學(xué)和血清學(xué)應(yīng)答Tab.2 Virological, biochemical and serological responses of 4 patients during TDF rescue treatment

2.3 患者在挽救治療期間的不良反應(yīng) 4例患者在TDF或TDF+ETV挽救治療10(3～28)個月后血清HBV DNA檢測不到，并在后續(xù)隨訪的15(10～37)個月仍維持此水平，ALT水平為15～67U/L，最終均恢復(fù)正常(＜40U/L)，均未出現(xiàn)病毒學(xué)突破(HBV DNA水平比治療中最低點(diǎn)上升1個log值，或一度轉(zhuǎn)陰后又轉(zhuǎn)為陽性)和ALT水平巨大波動(＞2×40U/L)。4例患者隨訪期間血清Cre維持在正常范圍內(nèi)(62～115μmol/L)，P2在隨訪第9個月時血磷水平下降，但未出現(xiàn)與之相關(guān)的臨床癥狀如骨密度減少和骨軟化癥等，在未改變TDF用量的情況下隨訪至38個月血磷水平恢復(fù)正常，其余3例患者隨訪期間血磷水平均維持正常(0.9～1.34mmol/L)，未出現(xiàn)與ADV、ETV或TDF相關(guān)的不良事件。

3 討 論

多項(xiàng)研究顯示，ETV+ADV對NAs治療失敗的ETV耐受患者具有良好的抗病毒活性[6-8]，但臨床上仍出現(xiàn)了許多ETV+ADV應(yīng)答不佳的患者。對ETV+ADV治療失敗的ETV耐藥患者的挽救治療選擇是困擾臨床的棘手問題。本研究分析了真實(shí)臨床實(shí)踐中4例NAs治療失敗并檢出ETV耐藥突變的HBV感染患者先后經(jīng)歷ETV+ADV聯(lián)合挽救治療應(yīng)答不佳、TDF±ETV繼續(xù)挽救治療期間的病毒學(xué)演變及臨床療效。4例患者在挽救治療前均檢出ETV耐藥變異位點(diǎn)，這些耐藥變異株可能與患者對ETV+ADV應(yīng)答不佳有關(guān)[9]。此外，患者對ETV+ADV應(yīng)答不佳也可能與ADV抗病毒活性低和其用藥劑量低(10mg/d)有關(guān)[10]。ADV的抗病毒活性與病毒載量有關(guān)，當(dāng)病毒載量很高時，更容易出現(xiàn)ADV應(yīng)答不佳[11]。本研究的4例患者中有3例在接受ETV+ADV治療前HBV DNA＞3.0log10IU/ml，其中1例患者HBV DNA＞7.0log10IU/ml，因此更易出現(xiàn)ADV應(yīng)答不佳。此外，分析發(fā)現(xiàn)RT區(qū)新型ADV耐藥變異rtA181S[12]以及潛在ADV耐藥變異rtV214A[13]的存在也可能是患者對ETV+ADV應(yīng)答不佳的原因之一。

有多項(xiàng)研究顯示TDF或TDF+ETV對多種NAs治療失敗的患者具有很好的療效[14-17]，但挽救治療期間病毒學(xué)動態(tài)演變的分析少見報道。本研究證實(shí)了ETV+ADV挽救治療應(yīng)答不佳的ETV耐藥患者以TDF±ETV繼續(xù)挽救治療可獲得很好的療效，結(jié)合動態(tài)克隆演變分析發(fā)現(xiàn)，即使臨床挽救治療達(dá)到血清HBV DNA檢測不到，仍有可能存在低水平病毒復(fù)制。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TDF±ETV挽救治療后實(shí)現(xiàn)完全病毒學(xué)應(yīng)答的快慢可能與病毒株是否持續(xù)存在有關(guān)。Lim等[18]報道了90例ETV耐藥患者，換用TDF或TDF+ETV治療11個月后85.6%的患者實(shí)現(xiàn)了血清HBV DNA檢測不到，僅有少數(shù)患者仍有前期存在的耐藥突變形式，與本研究結(jié)果相一致，說明ETV耐藥株的消失可能與患者快速實(shí)現(xiàn)完全病毒學(xué)應(yīng)答有關(guān)。而Gwak等[19]報道了90例ETV耐藥患者分別換用TDF或TDF+ETV治療，33個月后仍有6例患者HBV DNA＞60IU/ml，且其中2例仍可檢出前期存在的耐藥突變形式。本研究中P2在接受28個月的TDF+ETV治療后才實(shí)現(xiàn)HBV DNA檢測不到，克隆分析顯示仍存在ETV耐藥突變株，這種慢速實(shí)現(xiàn)完全病毒學(xué)應(yīng)答可能是導(dǎo)致TDF+ETV治療后ETV耐藥病毒持續(xù)存在的原因。

研究顯示，TDF治療經(jīng)治患者有較低的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率和HBsAg陰轉(zhuǎn)率[20-21]，與本研究結(jié)果相一致。此外，低血清學(xué)轉(zhuǎn)換率也可能與基因型有關(guān)，與其他基因型相比，C基因型獲得血清學(xué)轉(zhuǎn)換的概率更低，而本研究納入的4例患者均為C基因型[22]。

TDF與ADV類似，均經(jīng)腎臟排泄，對腎臟功能損傷的病例也頻見報道。TDF相關(guān)性腎損傷包括腎小管功能障礙、間質(zhì)性腎炎、急性腎小管壞死、范可尼綜合征等[23]。因此ADV經(jīng)治患者換用TDF是否會引起或加重腎損害也引起了臨床關(guān)注。多項(xiàng)研究表明，無論是TDF初治還是ADV經(jīng)治換用TDF均有良好的安全性和耐受性[24-26]。本研究4例患者也未出現(xiàn)與TDF相關(guān)的不良事件。

本研究雖然樣本量較少，但均是發(fā)生了ETV耐藥且對以往常用ETV+ADV挽救治療效果不佳的患者，隨訪治療時間長達(dá)11.09(9.33～13.08)年。本研究證實(shí)了ETV+ADV挽救治療應(yīng)答不佳的ETV耐藥患者以TDF±ETV繼續(xù)挽救治療可獲得良好療效，并發(fā)現(xiàn)ETV耐藥株檢測不到可能與患者實(shí)現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答的快慢以及早期演變?yōu)橐吧《居嘘P(guān)，但即使臨床治療達(dá)到血清HBV DNA檢測不到，仍有可能存在低水平病毒復(fù)制，提示對此類患者需長期應(yīng)用TDF±ETV抗病毒治療。

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