HPLC法測定注射用阿奇霉素枸櫞酸二氫鈉的含量及有關物質

柏大為，陳 佳（泰州市食品藥品檢驗所，江蘇泰州 225300）

阿奇霉素為15元環(huán)新型大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物[1-3]，結構上與紅霉素類似[4]，作用機制也相似，是通過抑制細菌蛋白質的合成而發(fā)揮作用，且具有抗菌譜廣、不良反應小等優(yōu)點[5-6]。由于阿奇霉素物質自身顯堿性，在一定酸性條件下不穩(wěn)定[2]；而阿奇霉素枸櫞酸二氫鈉是阿奇霉素的枸櫞酸二氫鈉鹽，穩(wěn)定性更高，且其溶液的pH值接近人體血液酸堿度（pH 7.35～7.45），因而刺激性小、耐受性更好。國家部頒標準[7]中對其含量采用抗生素微生物檢定法測定，對有關物質采用薄層色譜法測定。這2種方法操作均較復雜，試驗周期長，人為影響因素較多。筆者參考有關文獻[8-10]建立了高效液相色譜（HPLC）法測定注射用阿奇霉素枸櫞酸二氫鈉含量和有關物質的方法，結果表明建立的方法簡便、準確、專屬性強、重復性好，可用于注射用阿奇霉素枸櫞酸二氫鈉的含量及有關物質的測定。

1 材料

2695 HPLC儀、2996二極管陣列檢測器（DAD）、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；AG-135電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國密理博公司）。

樣品為市售注射用阿奇霉素枸櫞酸二氫鈉（浙江普洛康裕制藥有限公司，含量測定有2批，批號：20101210B、20080702，有關物質測定有5批，批號編號為1～5，規(guī)格：每支0.25 g）；阿奇霉素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130593-201002，純度：94.3%）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：資生堂C18MG Ⅱ柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液（取0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液，用20%的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至8.2）-乙腈（45∶55，V/V），流速：1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μl；檢測波長：215 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備。精密稱取阿奇霉素對照品53.00 mg，置于25 ml量瓶中，加流動相適量使其溶解，定容，搖勻，待用。

2.2.2 供試品溶液的制備。取樣品5支，精密稱定，研細；精密稱取細粉適量（約相當于阿奇霉素200.00 mg），置于100 ml量瓶中，加流動相適量使其溶解，定容，搖勻，過濾，待用。

2.3 阿奇霉素含量測定方法的建立

2.3.1 線性關系考察。精密稱取阿奇霉素對照品約212.06 mg，置于20 ml量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，制成10 mg/ml的溶液。精密量取上述溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml，分別置于10 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，按“2.1”項下色譜條件，進樣測定，以阿奇霉素質量濃度（x）為橫坐標，相應的峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，得線性方程為y＝9.59562x－0.16459（r＝0.9999）。結果表明，阿奇霉素檢測質量濃度線性范圍為0.5～3.0 mg/ml。

2.3.2 精密度試驗。取“2.2.2”項下供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰面積。結果RSD＝0.7%，表明精密度良好。

2.3.3 溶液穩(wěn)定性試驗。取“2.2.2”項下供試品溶液，于0、1、2、4、6、8 h分別進樣測定，記錄色譜峰面積。結果，阿奇霉素色譜峰的RSD＝0.8%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復性試驗。精密稱取樣品（批號：20101210B）6份，按“2.2.2”項下方法制備成6份供試品溶液，進樣測定，記錄色譜峰面積，以含量為指標計算RSD。結果樣品中阿奇霉素的平均含量為99.9%，RSD＝0.8%，表明本方法的重復性良好。

2.3.5 回收率試驗。精密吸取供試品溶液5 ml 9份，分別置于10 ml量瓶中，分別加入對照品溶液1、2、3 ml各3份，加流動相至刻度，搖勻，進樣測定，計算回收率。結果，供試品中阿奇霉素平均回收率為100.2%，RSD＝0.7%，詳見表1。

表1 回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.3.6 檢出限。取“2.2.1”項下對照品溶液稀釋70倍，進樣測定，記錄主成分峰高約為噪音峰高3倍時的色譜圖，測得其最低檢出限為4 μg/ml。

2.4 樣品含量測定

取樣品2批，分別按“2.2.2”項下方法每批制備3份供試品溶液，進樣測定并記錄峰面積；另取“2.2.1”項下對照品溶液，同法測定，記錄峰面積，阿奇霉素對照品以及供試品的色譜圖見圖1。按外標法以峰面積計算樣品中阿奇霉素的含量，并與抗生素微生物檢定法相比較，結果見表2。

圖1 主成分含量測定高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of main components

表2 2批樣品中阿奇霉素含量測定結果Tab 2 Results of content determination of azithromycin in 2 batches of samples

2.5 有關物質的專屬性試驗

2.5.1 高溫破壞試驗。取供試品溶液在100℃條件下放置30 min，取此樣液按有關物質測定法進行操作，圖譜出峰時間保留至主成分出峰時間的1.5倍。結果各雜質峰與阿奇霉素之間分離度＞1.5，分離效果良好，詳見圖2A。

2.5.2 酸破壞試驗。精密稱取樣品適量（約相當于阿奇霉素25 mg），置于25 ml量瓶中用流動相稀釋，加1 ml鹽酸（1 mol/L），在沸水浴中加熱25 min，冷卻，用氫氧化鈉（1 mol/L）調(diào)節(jié)至pH 7.0，過濾，按有關物質測定法操作。結果各雜質峰與阿奇霉素峰完全分離，詳見圖2B。

圖2 破壞性試驗高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of destroyed test

2.5.3 堿破壞試驗。精密稱取樣品適量（約相當于阿奇霉素25 mg），置于25 ml量瓶中，用流動相稀釋，加1 ml氫氧化鈉（1 mol/L），在沸水浴中加熱25 min，冷卻，用鹽酸（1 mol/L）調(diào)節(jié)至pH 7.0，過濾，按有關物質測定法操作。結果各雜質峰與阿奇霉素峰之間分離度＞1.5，實現(xiàn)完全分離，詳見圖2C。

2.5.4 氧化破壞試驗。精密稱取樣品適量（約相當于阿奇霉素25 mg），置于25 ml量瓶中，用流動相稀釋，加1 ml H2O2（30%），置于沸水浴中加熱20 min，冷卻，過濾，取此濾液按有關物質測定法操作。結果各雜質峰與阿奇霉素峰完全分開，有較好的分離度，詳見圖2D。

2.5.5 光照破壞試驗。取樣品適量，于4000 lx光照12 h后按有關物質測定方法操作。結果阿奇霉素峰與各雜質峰之間分離度＞1.5，完全分離，詳見圖2E。

2.6 樣品中有關物質的測定

采用不加校正因子的自身對照法來測定，結果5批樣品中有關物質的含量分別為0.9%、1.3%、1.2%、1.5%和1.1%。

綜合以上結果顯示，在建立的HPLC條件下，有關物質峰（降解產(chǎn)物峰）與主成分峰均達到基線分離，說明該色譜條件可用于阿奇霉素有關物質的檢測。

3 討論

（1）吸收波長的選擇。阿奇霉素為大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，紫外吸收較弱，通過DAD進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)其在200 nm波長附近有末端吸收。通過比較，在215 nm波長處阿奇霉素峰出峰良好，與相鄰雜質鋒分離顯著，雜質不干擾主藥測定，故選擇215 nm作為測定波長。

（2）色譜柱的選擇。阿奇霉素枸櫞酸二氫鈉pH值偏堿性，而普通C18色譜柱中的硅醇基會造成堿性化合物的峰形拖尾，所以選用了型號為MGⅡ的ODS色譜柱。該色譜柱采用高純度硅膠為基質，對硅膠表面進行了高分子包被，可最大限度地抑制硅醇基的影響，結果峰形滿意。

（3）溶劑的選擇。阿奇霉素對照品在乙腈中溶解較好，但阿奇霉素枸櫞酸二氫鈉在乙腈中溶解度不好，會產(chǎn)生渾濁。在采用流動相作溶劑后，溶解效果良好，對照品和樣品均能很好溶解，故選用流動相為溶劑。

綜上，通過本試驗表明，所建立的HPLC法與抗生素微生物檢定法含量測定結果基本一致，同時也可替代原薄層色譜法對有關物質的檢測；而且所建立的方法相對更簡便、快捷，并具有良好的準確性和重復性。

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