HPLC法測定注射用三磷酸胞苷二鈉的含量和有關(guān)物質(zhì)

張 彤，周長明，紀 宏，韓南銀（1.北京大學藥學院，北京 100091；.北京市藥品檢驗所，北京100035）

三磷酸胞苷二鈉（CTP）是核苷酸類衍生物，屬于輔酶類藥物，在機體內(nèi)參與磷脂類及核酸的合成和代謝，是腦磷脂合成與核酸代謝的中間產(chǎn)物和能量來源[1-2]，對顱腦外傷后綜合征及其后遺癥有良好的治療作用。注射用CTP國家標準的含量測定方法為紙電泳法[3]，該法操作煩瑣、誤差較大，且此標準中未對有關(guān)物質(zhì)進行控制。由于CTP分子間存在高能磷酸鍵，注射用CTP在生產(chǎn)和貯存過程中很容易發(fā)生磷酸鍵斷裂，降解成一磷酸胞苷二鈉（CMP）、二磷酸胞苷二鈉（CDP）等，從而對產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生影響。

筆者建立了CTP含量測定及有關(guān)物質(zhì)檢查的高效液相色譜（HPLC）法，結(jié)果表明該方法操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好、專屬性和耐用性較強。經(jīng)方法學驗證，該方法適用于CTP的質(zhì)量控制。采用本方法對12個廠家的25批市售樣品進行考察，結(jié)果表明不同廠家的產(chǎn)品質(zhì)量存在較大差異。故本法也為廠家進一步從原輔料的選擇、處方和工藝的優(yōu)化等方面提供了較強的指導(dǎo)意義。

1 材料

LC-20AT型HPLC儀、SPD-M20A二極管陣列檢測器、LC-solution色譜工作站（日本島津公司）；AE-240天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

CTP對照品（蕪湖華仁科技有限公司，批號：11011909，純度：98.2%，水分：3.7%；美國Sigma公司，批號：BCBC2057，純度：95%，水分：2.1%）；CDP對照品（蕪湖華仁科技有限公司，批號：11042913，純度：98.6%，水分：2.3%）；CMP對照品（美國Sigma公司，批號：070MM1493V，純度：99.7%，水分：23.1%）；注射用CTP市售樣品（共12個廠家25批樣品，規(guī)格：每支40 mg）；四丁基溴化銨及其他試劑均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鈉17.8 g、磷酸二氫鉀6.8 g，加水900 ml溶解，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入四丁基溴化銨0.80 g，加水至1000 ml，搖勻），流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液制備

對照品溶液：精密稱取CTP對照品適量，用流動相定量稀釋制成每1 ml中約含0.4 mg的溶液，搖勻即得。

含量測定溶液：取樣品加流動相溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含0.4 mg的溶液，搖勻即得。

有關(guān)物質(zhì)檢查溶液：取樣品3支，加流動相將內(nèi)容物溶解并全量轉(zhuǎn)移至適宜的量瓶中，加流動相定量稀釋制成每1 ml中約含0.4 mg的溶液，搖勻，作為供試溶液。精密量取供試溶液5 ml，置于100 ml量瓶中，加流動相定容至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.3 有關(guān)物質(zhì)檢測方法

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗。取對照品溶液進樣分析，理論板數(shù)按三磷酸胞苷計不低于3000，三磷酸胞苷與二磷酸胞苷峰及與其后相鄰色譜峰之間的分離度均應(yīng)＞2.0。含量測定按峰面積以外標法計算。有關(guān)物質(zhì)記錄色譜圖至主成分保留時間的2倍，以主成分自身對照法計算有關(guān)物質(zhì)的量。

2.3.2 專屬性試驗。取樣品（安徽A廠，批號：101112）適量（約相當于CTP 20 mg）3份，分別加入1 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml、1 mol/L鹽酸1 ml、10%過氧化氫（H2O2）溶液1 ml，室溫下放置1 h后中和；另取樣品2份置于105℃烘箱中加熱破壞2 h或在紫外燈下照射1 d。分別加水定容至50 ml，取20 μl進樣分析。結(jié)果表明，本品經(jīng)熱破壞后，產(chǎn)生的雜質(zhì)峰均能與主峰基線分離，說明該色譜系統(tǒng)能有效檢測CTP的分（降）解產(chǎn)物；而本品對酸、堿、氧化和光穩(wěn)定。色譜見圖1。

圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of specificity tests

2.3.3 響應(yīng)因子測定。用國產(chǎn)和進口CTP對照品、國產(chǎn)CDP對照品及進口CMP對照品初步考察了CDP和CMP與CTP質(zhì)量濃度相同時在280 nm檢測波長處的峰面積之比。結(jié)果表明，CTP（國產(chǎn)）/CDP峰面積之比為0.8004，CTP（進口）/CDP之比為0.8191，CTP（國產(chǎn)）/CMP之比為0.6195，CTP（進口）/CMP之比為0.6340。這與CMP/CTP分子質(zhì)量比值0.622和CDP/CTP分子質(zhì)量比值0.811基本一致。

2.3.4 定量限。根據(jù)測試溶液質(zhì)量濃度和進樣體積計算，CTP定量限（信噪比為10）為7.4 ng，CDP定量限（信噪比為10）為1.08 ng，CMP定量限（信噪比為10）為0.21 ng。

2.4 含量測定方法

2.4.1 線性關(guān)系。精密稱取進口CTP對照品約0.45 g，置于200 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，再精密量取5 ml，分別置于10、25、50、100 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得質(zhì)量濃度分別為1860、930、372、186、93 mg/L的對照品溶液。精密量取上述5種溶液各20 μl進樣分析，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（c，mg/L）對峰面積（A）進行回歸，得回歸方程A＝9.724×103c+2.156×105（r＝0.9997，n＝5），表明CTP檢測質(zhì)量濃度線性范圍為90～1800 mg/L。

2.4.2 精密度試驗。取質(zhì)量濃度約為400 mg/L的對照品溶液，連續(xù)進樣6次。結(jié)果，其峰面積的RSD＝0.28%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗。取同一批樣品，測定6次，結(jié)果平均含量101.0%，RSD＝1.4%（n＝6）。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗。精密量取進口CTP對照品溶液，在室溫下經(jīng)3、5、8、19、25 h放置后分別進樣。結(jié)果RSD＝0.9%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置25 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 回收率試驗。精密量取對照品溶液（約1000 mg/L）3、4、5 ml各3份，分別置于10 ml量瓶中，加處方量的輔料溶液稀釋至刻度。按含量測定方法，精密量取上述溶液各20 μl進樣分析，記錄色譜圖，計算回收率。結(jié)果，平均回收率為102.1%，RSD＝1.65%（n＝9），詳見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.4.6 耐用性試驗。取同一批樣品，采用不同廠牌4種色譜柱測定，評價系統(tǒng)適用性相關(guān)指標。結(jié)果，CTP理論板數(shù)均＞3000，其中3種色譜柱CTP與CDP分離度＞2.0。

2.5 樣品測定

取各市售樣品，按“2.2”項下方法制備成含量測定樣品溶液，同時取不含CTP的輔料同法制備成空白溶液及進口CTP對照品溶液，在“2.1”項下色譜條件依法測定，記錄色譜圖見圖2（圖2為安徽A廠產(chǎn)品，批號：101112）；含量和有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果見表2。

3 討論

3.125 批樣品考察結(jié)果分析

根據(jù)國家藥典委員會2010－2011年度國家藥品標準提高工作的相關(guān)要求，需對注射用CTP的質(zhì)量標準進行補充與提高工作。目前國內(nèi)該品種共有31個批準文號，最終收集到12家企業(yè)的25批樣品。筆者根據(jù)原質(zhì)量標準建立了含量和有關(guān)物質(zhì)測定方法及考察了其方法學，并利用建立的方法對25批市售產(chǎn)品進行了質(zhì)量考察和對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射用CTP主要市售產(chǎn)品間主成分含量和有關(guān)物質(zhì)含量均存在顯著性差異。

3.2 流動相的考察

圖2 含量測定高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of content determination

表2 25批樣品含量和有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果Tab 2 Results of content and related substance determination of 25 batches of samples

文獻[4-6]報道常用的流動相為水相或水相與有機相甲醇混合。筆者在前期試驗中對多種流動相進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在水相中加入甲醇會使主峰保留時間縮短。水相多采用磷酸鹽緩沖液，用氫氧化鈉或三乙胺調(diào)節(jié)pH值。pH升高會延長主峰保留時間，有利于分離，普通液相色譜柱的pH使用高限為7。在流動相中加入一定量的離子對試劑四丁基溴化銨可改善分離度。磷酸鹽濃度和離子對試劑濃度均對主峰保留時間有一定影響，通常較高的鹽濃度能縮短主峰保留時間，而增加離子對試劑濃度可改善分離度。經(jīng)過對不同流動相所記錄色譜圖的綜合分析與比較（保留時間、峰形、理論板數(shù)、分離度），最終確定采用本法中的流動相。

3.3 檢測波長的確定

本試驗采用二極管陣列檢測器，所以可以方便地得到供試品的紫外圖譜。在試驗中發(fā)現(xiàn)，CTP在280 nm波長處有最大吸收，CMP和CDP均在279 nm波長有最大吸收，并且空白溶液在280 nm波長處無紫外吸收，因此確定280 nm為本試驗的檢測波長。

3.4 定量方法的確定

CTP含量測定的方法文獻報道很多。其中包括地標升國標（第16冊）[3]的紙電泳法。紙電泳法操作煩瑣，手動點樣準確度低，且試驗過程中干擾測定結(jié)果的因素較多，最終造成結(jié)果的重現(xiàn)性較差。另外也有采用HPLC法利用經(jīng)典公式計算CTP的質(zhì)量比（%），再結(jié)合紫外吸收系數(shù)法測定總核苷酸（即CTP、CMP和CDP及其他可能存在的核酸類成分的總量），最終計算得到CTP含量[7-10]。此方法不使用CTP對照品，主要是考慮CTP對照品一般純度不高，多含CMP和CDP等有關(guān)物質(zhì)，并具有較強的引濕性，且對溫度敏感，需低溫保存。另外在計算CTP的質(zhì)量比的公式中使用的0.655和0.848分別作為CMP和CDP的折算系數(shù)，但在采用不同對照品的實際測定結(jié)果顯示與此數(shù)值有差異?？紤]到工藝和保存條件等的提高，對照品法是更加簡易可行的方法。

本方法也同樣適用于注射用CTP中有關(guān)物質(zhì)的檢查。在保證主成分與有關(guān)物質(zhì)峰的良好分離下，同時滿足為縮短試驗周期對運行時間的需要，采用自身對照法定量測定有關(guān)物質(zhì)。由于CDP和CMP紫外響應(yīng)高于CTP，所以實際含量低于給出的結(jié)果，但不影響不同廠家間產(chǎn)品的質(zhì)量評價。

綜上所述，本試驗方法操作簡便、快速、專屬性強、靈敏度高、重復(fù)性和耐用性好、結(jié)果準確，與原標準比較能夠更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。本文的有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果對有關(guān)生產(chǎn)企業(yè)加強原輔料質(zhì)量控制、改進工藝并通過穩(wěn)定性試驗考察制訂更加合理的貯藏條件和效期具有較強的指導(dǎo)意義。

[1]國家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于修訂三磷酸胞苷二鈉制劑說明書的通知[S].2006-02-22.

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[3]國家食品藥品監(jiān)督管理局.化學藥品地方標準上升國家標準：16冊[S].2003：270-272.

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[8]國家食品藥品監(jiān)督管理局.YBH24542006注射用三磷酸胞苷二鈉[S].2006.

[9]國家食品藥品監(jiān)督管理局.YBH24472006注射用三磷酸胞苷二鈉[S].2006.

[10]國家食品藥品監(jiān)督管理局.YBH04792008注射用三磷酸胞苷二鈉[S].2008.