高效分子排阻色譜法測(cè)定頭孢氨芐原料藥中聚合物的含量

苑華，張冬，黃亞龍，張文勝（1.石家莊食品藥品檢驗(yàn)所，石家莊05001；.河北省食品藥品檢驗(yàn)院，石家莊 050011；.華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司，石家莊 050000）

研究[1]表明，β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物引發(fā)的速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)并非抗菌藥物本身所致，而是與藥物中存在的高分子聚合物雜質(zhì)有關(guān)。頭孢氨芐收載于2010年版《中國(guó)藥典》（二部）[2]，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)高分子聚合物進(jìn)行控制。為此，筆者建立了以TSK-GEL G2000SWXL為色譜柱的高效分子排阻色譜法[3]分析測(cè)定頭孢氨芐中聚合物含量的方法，結(jié)果表明該法分離效能高、檢驗(yàn)周期短、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 材料

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）。

頭孢氨芐對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130408-200710，純度：94.4%）；頭孢氨芐原料藥樣品（華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司，樣品1：批號(hào)：20120101，純度：95.1%；樣品2：批號(hào)：20120102，純度：95.2%；樣品3：批號(hào)：20120103，純度：95.2%）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：TSK-GEL G2000SWXL（300 mm×7.8 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.005 mol/L磷酸鹽緩沖液[0.005 mol/LNaH2PO4溶液-0.005 mol/L Na2HPO4（39∶61，V/V）]-乙腈（95∶5，V/V），流速：0.6 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備及測(cè)定方法

取樣品適量，精密稱定，加水制成每1 ml中含頭孢氨芐2.0 mg的溶液，作為供試品溶液（臨用新制）；另取頭孢氨芐對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1 ml中約含20μg的溶液，作為對(duì)照溶液。分別進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算保留時(shí)間小于頭孢氨芐的雜質(zhì)總量。結(jié)果見圖1。

2.3 破壞試驗(yàn)

高溫破壞：取頭孢氨芐對(duì)照品溶液（2.0 mg/ml）10 ml，于60℃水浴中放置10 min，取出，冷卻至室溫。

堿破壞：稱取頭孢氨芐對(duì)照品約20 mg，置于10 ml量瓶中，加0.1 mol/L NaOH溶液1.0 ml溶解，放置1 min后，加0.1 mol/L HCl 1.0 ml，用水稀釋至刻度。

酸破壞：稱取頭孢氨芐對(duì)照品約20 mg，置于10 ml量瓶中，加0.1 mol/L HCl溶液1.0 ml溶解，放置4 h后，加0.1 mol/L NaOH 1.0 ml，用水稀釋至刻度。

氧化破壞：稱取頭孢氨芐對(duì)照品約20 mg，置于10 ml量瓶中，加3%H2O2溶液1.0 ml溶解，放置5 min后，用水稀釋至刻度。

光破壞：取頭孢氨芐對(duì)照品溶液（2.0 mg/ml）10 ml，于5000 lx照度下放置8 h。

采用選定的色譜條件取上述溶液進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，破壞處理之后的樣品雜質(zhì)峰均有所增加，且各主峰前聚合物峰均能與主成分峰充分分離，其保留時(shí)間與未破壞樣品溶液色譜圖中的聚合物峰一致。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取頭孢氨芐對(duì)照品適量，加水溶解并稀釋制成系列線性試驗(yàn)溶液，質(zhì)量濃度分別為0.56、1.0、2.0、3.5、7.0、14.0、28.0 μg/ml，進(jìn)樣測(cè)定，并以相應(yīng)組分的色譜峰面積（A）對(duì)其質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程如下：A＝55592c－1474.1（r＝0.9999）。結(jié)果表明，頭孢氨芐檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.56～28.0 μg/ml。

2.5 檢測(cè)限及定量限試驗(yàn)

精密稱取頭孢氨芐對(duì)照品適量，分別用水稀釋成每1 ml中含頭孢氨芐10、5、2.5、1、0.5 μg的系列溶液，進(jìn)樣測(cè)定，按信噪比為3測(cè)得頭孢氨芐檢測(cè)限為1.0 ng，按信噪比為10測(cè)得定量限為3.0 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為7.0 μg/ml對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果頭孢氨芐峰面積的RSD＝0.3%（n＝6），表明本法精密度好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備6份供試品溶液，分別立即進(jìn)樣分析，測(cè)定聚合物的總量。結(jié)果RSD＝2.4%（n＝6），表明本法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取含頭孢氨芐2.0 mg/ml的供試品溶液適量，在室溫下放置，于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h分別測(cè)定，8 h內(nèi)雜質(zhì)峰面積之和逐漸增大，3～4 h增加較大，表明供試品溶液不穩(wěn)定。因此供試品溶液應(yīng)臨用新制。

2.9 樣品中聚合物的測(cè)定

按“2.2”項(xiàng)下方法對(duì)3批樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表1。

表1 3批樣品中聚合物測(cè)定結(jié)果Tab 1 Results of content determination of polymers in 3 batches of samples

3 討論

（1）緩沖液的選擇。在前期試驗(yàn)中筆者對(duì)不同離子強(qiáng)度的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相進(jìn)行了考察，A為0.0025 mol/L，B為0.005 mol/L，C為0.01 mol/L。試驗(yàn)結(jié)果表明，A與C所檢出的雜質(zhì)峰較少，B所檢出的雜質(zhì)峰較多且實(shí)現(xiàn)了主峰與雜質(zhì)峰間的有效分離，故選擇0.005 mol/L磷酸鹽緩沖液。

（2）流動(dòng)相中乙腈比例的選擇。分別選取乙腈比例為5%、10%進(jìn)行考察。結(jié)果，乙腈比例為5%時(shí)檢出色譜峰較多，故流動(dòng)相選用乙腈比例為5%。

（3）流動(dòng)相pH值的選擇。頭孢類抗菌藥物在堿性、偏酸性及酸性條件下極易發(fā)生聚合反應(yīng)，測(cè)得的聚合物含量難以反映樣品本身的實(shí)際情況。故筆者參考2010年版《中國(guó)藥典》（二部）相關(guān)內(nèi)容，采用pH值7.0的磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相。

（4）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。用二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定堿破壞供試品溶液，采集到主峰前各高分子雜質(zhì)峰的紫外光譜圖，雜質(zhì)1～3的最大吸收波長(zhǎng)集中于220～230 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)；雜質(zhì)4未見明顯吸收峰，但于240～200 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)呈現(xiàn)遞增的吸收狀態(tài)；雜質(zhì)5于262 nm波長(zhǎng)處呈現(xiàn)最大吸收，其吸收值與220 nm波長(zhǎng)處的吸收值較接近；頭孢氨芐于257 nm波長(zhǎng)處呈現(xiàn)最大吸收，其吸收值亦與220 nm波長(zhǎng)處的吸收值較接近。為保證最大雜質(zhì)檢出量，檢測(cè)波長(zhǎng)定為220 nm。

（5）由于結(jié)構(gòu)不同的聚合物通常具有相同的生物學(xué)特性，且聚合物又具有高度的不均一性，因此在藥品質(zhì)量控制中只需控制聚合物總量即可[1]。

（6）本方法與以葡聚糖凝膠Sephadex G-10作為分離介質(zhì)的分子排阻法[4]相比較，具有檢驗(yàn)周期短（本文方法約20 min，葡聚糖凝膠Sephadex G-10方法約為60 min）、操作簡(jiǎn)單、分離效果好的優(yōu)點(diǎn)，這可能是因?yàn)門SK-GEL G2000SWXL系球型硅膠基質(zhì)在其表面通過(guò)共價(jià)鍵化學(xué)鍵合親水基團(tuán)構(gòu)成的物質(zhì)，其吸附及分子篩效應(yīng)強(qiáng)于Sephadex G-10葡聚糖凝膠顆粒。以TSK-GEL G2000SWXL為色譜柱的方法是凝膠色譜發(fā)展的必然趨勢(shì)。

[1]袁雯瑋.高分子聚合物研究與中國(guó)藥典2005年版B2內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物修訂情況及操作要點(diǎn)[J].中國(guó)抗生素雜志，2005，30（12）：727.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：208.

[3]王成剛，曹軼，張喆，等.高效分子排阻色譜法分析頭孢噻肟鈉中的聚合物[J].藥物分析雜志，2009，29（5）：814.

[4]伍蓉.分子排阻色譜法測(cè)定頭孢氨芐聚合物[J].國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，2012，33（2）：83.