冬蟲夏草對(duì)VDR沉默大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP19表達(dá)的影響

貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002

卵巢作為女性的生殖腺，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)-下丘腦-垂體軸的調(diào)控之下，完成排卵和內(nèi)分泌的功能[1]。女性進(jìn)入圍絕經(jīng)期以后，卵泡數(shù)量逐漸減少，引起骨質(zhì)疏松、抑郁、心血管疾病等，嚴(yán)重影響婦女的身心健康和生活質(zhì)量[2]。目前西醫(yī)治療主要采用激素替代療法，長(zhǎng)期應(yīng)用不良反應(yīng)較為突出。中醫(yī)藥補(bǔ)腎益精療法有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。近年對(duì)Vitamin D Receptor(VDR) 和1a-羥化酶基因沉默動(dòng)物不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，維生素D對(duì)生殖功能的影響發(fā)揮作用。VDRmRNA表達(dá)已被證實(shí)是在卵巢[3]，在混合卵巢細(xì)胞及凈化的卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)性激素類固醇生成起重要作用[3]。芳香化酶在雌激素合成過(guò)程中具有重要作用，無(wú)論雄性或雌性小鼠，VDR敲除后性腺芳香化酶(P450arom)活性低下，CYP19表達(dá)明顯降低。

維生素D能直接調(diào)節(jié)CYP19基因表達(dá)，從而調(diào)控雌激素分泌[4]。維生素D通過(guò)25-羥基維生素D 1-羥化酶(CYP27B1)在肝臟和腎臟中的活性形式(1,25-二羥維生素D)進(jìn)行修飾，激活的維生素D通過(guò)維生素D受體(VDR)產(chǎn)生作用，這個(gè)系統(tǒng)在國(guó)外稱作維生素D軸[5]( Vitamin D system)，我國(guó)稱其為維生素D軸(Vitamin D axis)[6-13]。腎精虧損將導(dǎo)致生殖功能發(fā)生障礙。筆者中藥能使大鼠卵巢重量明顯增長(zhǎng)。補(bǔ)腎法治療可以提高體內(nèi)雌激素水平,增強(qiáng)各激素靶器官的反應(yīng)性[14]。

冬蟲夏草是一種含有氨基酸、甘露醇、核苷、多糖、甾醇等多種活性成分的名貴中藥材，具有補(bǔ)腎填精、納氣平喘的功效。冬蟲夏草具有調(diào)節(jié)雌激素分泌作用[15]，腎精虧損將導(dǎo)致生殖功能發(fā)生障礙。筆者基于前期文獻(xiàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，探討冬蟲夏草對(duì)VDR沉默卵巢顆粒細(xì)胞CYP19mRNA表達(dá)的影響，揭示其對(duì)卵巢功能的保護(hù)作用并提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雌性36只，大鼠購(gòu)買于重慶解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重約150～180 g。許可證號(hào)：SCXK-(軍)20120011。

1.2 試劑及儀器 主要儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Eppendorf，德國(guó))，電泳儀(Bio-rad，美國(guó))，凝膠成像儀穩(wěn)壓DNA電泳儀(Tianneng，美國(guó))，GDS8000凝膠掃描系統(tǒng)(UVP，美國(guó))，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)，電熱壓力蒸汽消毒器(浙江紹興醫(yī)療器械總廠)，高速臺(tái)式離心機(jī)(BACKMAN CS-15R，美國(guó)Beckman公司)。主要試劑:超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、2×EsTaqMasterMix(含染料)(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

表1 基因序列

1.3 方法

1.3.1 顆粒細(xì)胞培養(yǎng) 3～4周健康雌性SD大鼠，麻醉后取雙側(cè)卵巢，在解剖顯微鏡下剝離周圍脂肪組織，PBS沖洗后剪碎，用0.2%膠原酶及與0.25%胰蛋白酶消化25～30 min，加入DMEM/F12終止消化，以1000 r /min轉(zhuǎn)速離心5min后去除上清液，過(guò)篩后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37℃+5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞(GC)密度適中進(jìn)行傳代。

1.3.2 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞藥物模型構(gòu)建 將正常卵巢顆粒細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行相應(yīng)處理。對(duì)照組、基因沉默陰性對(duì)照組、VDR沉默組按照常規(guī)培養(yǎng)的方式加入含15%血清的DMEM-F12完全培養(yǎng)基[16]。已烯雌酚組、維生素D組、蟲草素處理組分別于正常大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中加入含已烯雌酚、維生素D、高劑量蟲草素的含藥血清的培養(yǎng)基，干預(yù)處理24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。VDR沉默+已烯雌酚組、VDR沉默+維生素D組、VDR沉默+蟲草素處理組分別于VDR沉默轉(zhuǎn)染后的卵巢顆粒細(xì)胞加入含已烯雌酚、維生素D、高劑量蟲草素的含藥血清的培養(yǎng)基，干預(yù)處理24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 1：對(duì)照組；2：基因沉默陰性對(duì)照組；3：VDR沉默組；4：VDR沉默+已烯雌酚組；5：VDR沉默+維生素D組；6：VDR沉默+蟲草含藥血清處理組。采用熒光定量PCR檢測(cè)法檢測(cè)VDR沉默大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP19 mRNA表達(dá)。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組、基因沉默陰性對(duì)照組相比，VDR沉默組CYP19mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，VDR沉默+己烯雌酚組、VDR沉默+VD組、VDR沉默+冬蟲夏草含藥血清組與VDR沉默組比較，CYP19mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。

對(duì)照組基因沉默陰性對(duì)照組VDR沉默組VDR沉默+已烯雌酚組VDR沉默+維生素D組VDR沉默+蟲草含藥血清處理組11.07±0.290.38±0.17*0.7±0.19#0.66±0.18#0.74±0.24#

注：與對(duì)照組、基因沉默陰性對(duì)照組比較，*P<0.05；與VDR沉默組比較，#P<0.05。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為腎藏精主生殖，生殖功能是通過(guò)腎中先天之精激發(fā)而產(chǎn)生的，卵巢功能低下就其本質(zhì)而言即為腎精不足，故而臨床對(duì)于卵巢功能低下的治療多從補(bǔ)腎填精入手。由于中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究對(duì)象的同一性，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明維生素D缺乏影響卵巢的組織形態(tài)及性腺分泌功能，實(shí)驗(yàn)表明維生素D在調(diào)節(jié)卵巢活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，維生素D不僅僅是維生素，還是一種激素，稱之為維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)[17]。該系統(tǒng)包括維生素D、代謝相關(guān)的酶以及維生素D作用的受體(VDR)[18]。除了鈣磷代謝外，維生素D在調(diào)控細(xì)胞有絲分裂，抑制多種組織細(xì)胞增殖、分化等方面都發(fā)揮較大作用。維生素D還有調(diào)節(jié)免疫、糖代謝、調(diào)控腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(RAS)等多種生物學(xué)作用，作用廣泛，在多個(gè)系統(tǒng)中發(fā)揮重大作用[8-9]。在下丘腦垂體軸的調(diào)控下，卵巢完成排卵和分泌性激素的功能。女性進(jìn)入圍絕經(jīng)期以后，卵泡數(shù)量逐漸減少，可能誘發(fā)心血管疾病以及骨質(zhì)疏松，嚴(yán)重影響婦女的身心健康和生活質(zhì)量。目前西醫(yī)治療主要采用激素替代療法，長(zhǎng)期應(yīng)用有很多不良反應(yīng)。中醫(yī)藥補(bǔ)腎填精療法有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其療效在臨床已經(jīng)逐步得到驗(yàn)證，而其機(jī)制有待進(jìn)一步闡釋。近年對(duì)VDR和1a-羥化酶基因沉默動(dòng)物不斷深入研究，可以發(fā)現(xiàn)維生素D對(duì)生殖功能的影響發(fā)揮作用。VDRmRNA表達(dá)已被證實(shí)是在卵巢，在混合卵巢細(xì)胞及凈化的卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)性激素類固醇生成起作重要作用。本研究采用熒光定量PCR檢測(cè)法檢測(cè)冬蟲夏草對(duì)VDR沉默大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中CYP19mRNA表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組、基因沉默陰性對(duì)照組相比，VDR沉默組CYP19mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，VDR沉默+己烯雌酚組、VDR沉默+VD組、VDR沉默+冬蟲夏草含藥血清組與VDR沉默組比較，CYP19mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，冬蟲夏草具有一定的調(diào)節(jié)維生素D軸的功能。

4 結(jié)論

綜上所述，冬蟲夏草對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的保護(hù)與促進(jìn)作用與維生素D、己烯雌酚相似，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)冬蟲夏草對(duì)卵巢功能的保護(hù)作用通過(guò)維生素D軸發(fā)揮效應(yīng)，冬蟲夏草可以通過(guò)調(diào)節(jié)CYP19產(chǎn)生類維生素D樣作用,對(duì)大鼠的卵巢顆粒細(xì)胞分泌功能產(chǎn)生影響，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)維生素D軸對(duì)大鼠的卵巢產(chǎn)生保護(hù)作用。但導(dǎo)致卵巢功能低下的因素眾多，冬蟲夏草是否還可以通過(guò)其他機(jī)制來(lái)改善卵巢功能，還有待更進(jìn)一步的研究。

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