HPLC-DAD法測(cè)定藍(lán)花參中橙皮苷含量

文清

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建職業(yè)衛(wèi)生技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350101;3. 福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬福建省級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院，福建 福州 350003

藍(lán)花參(Wahlenbergiamarginata(Thunb.) A. DC.)為桔梗科藍(lán)花參屬的植物，入藥部位為根或全草，具有益氣健脾、祛痰止咳的功效，臨床上常用于治療氣管炎、百日咳[1]等疾病。目前發(fā)現(xiàn)藍(lán)花參中含有甾體類化合物如β-谷甾醇葡萄糖苷、多炔類化合物如黨參炔苷、苯丙素類化合物如Wahlenbergioside及揮發(fā)油如n-十六烷酸[2-4]等化學(xué)成分。橙皮苷為課題組首次于藍(lán)花參中發(fā)現(xiàn)的黃酮類物質(zhì)，其相對(duì)分子量為610.56 kD[5]。大量的研究表明[6]，橙皮苷在抗腫瘤、心血管保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)及過(guò)敏性哮喘等方面皆有良好的治療效果。本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)法測(cè)定藍(lán)花參中橙皮苷含量，為建立快速準(zhǔn)確測(cè)定藍(lán)花參中的橙皮苷提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters H-class高效液相色譜儀(配有在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Waters公司)；SB-5200DT超聲波提取器(寧波新芝生物科技股份有限公司，批號(hào)：131897)；BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，批號(hào)：2014-03)。

1.2 材料 藍(lán)花參全草干品購(gòu)于福州回春中藥飲片廠有限公司(批號(hào)：14010507)，經(jīng)福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系朱扶蓉副教授鑒定為[Wahlenbergia marginata(Thunb.) A.DC.]。

橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)：K02M3C1，上海源葉生物科技有限公司)，HPLC級(jí)乙腈(批號(hào)：20150402)、甲醇(批號(hào)：20160411，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；AR，級(jí)乙酸(批號(hào)：0812181)、甲酸(批號(hào)：1608241，汕頭市西隴化工廠有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 流動(dòng)相乙腈(A)-1%乙酸水(B)，梯度洗脫(0～1 min，5%～15%A；1～4 min，15%～20%A；4～7 min，20%～25%A；7～10 min，25%～30%A；10～13 min，30%～35%A；13～16 min，35%～40%A；16～20 min，40%～60%A；20～23 min，60%～70%A)；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)268 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL。見(jiàn)圖1所示。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱定橙皮苷對(duì)照品1.036 mg于10 mL容量瓶中，加入甲醇，超聲溶解，定容，得到濃度為1.036 mg/mL的對(duì)照品貯備液。

2.3 供試品溶液制備 精密稱定藍(lán)花參藥材約2.0 g，精密加入40%乙醇50 mL，稱定重量，超聲30 min(250 W、50 Hz)后取出，放至室溫，補(bǔ)足重量，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密量取橙皮苷對(duì)照品溶液適量，稀釋成一系列對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)x，峰面積(A)為縱坐標(biāo)y，得回歸方程：y=0.101x+0.401(r=0.9965)，線性范圍為4.144～82.88 μg/mL。如圖2所示。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液2 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。橙皮苷峰面積RSD為0.35%，橙皮苷保留時(shí)間(tR)RSD為0.14%，表明該儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定藍(lán)花參藥材約2.0 g，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，于0，1，2，4，8，12 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。橙皮苷峰面積RSD為0.51%，說(shuō)明該供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定藍(lán)花參藥材約2.0 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，平行操作6次。橙皮苷的平均含量為698.209 μg/g，RSD為0.47%，說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同批藍(lán)花參藥材6份，每份約1.0 g，均精密加入橙皮苷對(duì)照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。橙皮苷的平均加樣回收率為97.63%，RSD為1.39%。說(shuō)明該方法準(zhǔn)確性高。見(jiàn)表1。

表1 橙皮苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)試 精密稱取藍(lán)花參2 g，平行3份，按照“2.3“項(xiàng)下制備供試品溶液，按”2.1”項(xiàng)下色譜條件分別對(duì)3份樣品進(jìn)行測(cè)定，橙皮苷含量分別為681.221 μg/g、675.365 μg/g、684.981 μg/g，平均值為680.522 μg/g，RSD為0.62%。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道[7]橙皮苷具有較強(qiáng)的抗炎作用，對(duì)4種炎癥模型均表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用，而藍(lán)花參經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其高、中劑量均具有抗炎消腫作用[8]。由此推斷橙皮苷有可能是其抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ)之一，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證。

藍(lán)花參中橙皮苷的含量測(cè)定未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，故試驗(yàn)采用HPLC-DAD法對(duì)藍(lán)花參中橙皮苷含量進(jìn)行快速檢測(cè)，該法簡(jiǎn)便易行，且精密度、準(zhǔn)確性、重復(fù)性均良好，為建立快速準(zhǔn)確測(cè)定藍(lán)花參中的橙皮苷提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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