降脂寧有效部位提取純化工藝研究

李麗華，楊瑞靜，姜艷艷，劉 斌

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488)

降脂寧顆粒收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準:中藥成方制劑》[1]，由山楂、荷葉、制何首烏和決明子4味藥組成，具有降血脂和軟化血管的功能，用于增強冠狀動脈血液循環(huán)，治療心律不齊及高脂血癥。山楂為方中君藥，主要有效成分為黃酮類和三萜類[2-3]，荷葉為臣藥，主要有效成分為黃酮類和生物堿類[4]，具有抗氧化、降壓降血脂、抗心律不齊、增加冠狀動脈流和保護心血管等作用[3-7]。制何首烏和決明子為佐使藥，主要有效成分分別為二苯乙烯苷類[8]、蒽醌類[9-10]及萘并吡喃酮類[11]，具有抗氧化、降壓降脂和保肝等作用[9-12]。

本課題組前期對降脂寧降血脂藥效及其作用機制開展了研究，結(jié)果顯示，其作用機制是通過調(diào)節(jié)膽固醇吸收、合成和轉(zhuǎn)化實現(xiàn)的[13-15]。同時，課題組也對降脂寧有效部位開展了藥效研究，發(fā)現(xiàn)其亦有降血脂作用，且在藥效作用上與降脂寧提取物具有等效性[16]。因此，本實驗以總黃酮、總蒽醌、總生物堿和2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷為考察指標，采用正交實驗和單因素實驗篩選適用于工業(yè)化生產(chǎn)的降脂寧有效部位提取純化工藝，以實現(xiàn)降脂寧的二次開發(fā)應(yīng)用。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 1525高效液相色譜儀，Empower色譜工作站(美國沃特公司)；Sartorious BT 25S型十萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；Hitachi U-2000型紫外-可見分光光度計(日本日立公司)；UJS離心機(德國大陸集團)；BUCHI Rotavapor R-220 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士布奇有限公司)。

1.2試藥 制何首烏(產(chǎn)地湖北，批號601100089)，荷葉(產(chǎn)地河北，批號601000998)，山楂(產(chǎn)地河北，批號1601000906)，決明子(產(chǎn)地安徽，批號70025002)，均購自北京同仁堂醫(yī)藥集團北城批發(fā)部，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系張媛副教授鑒定。蘆丁(批號MUST-16111111)和2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(SBGC)(批號MUST-16021005)，均購自成都曼斯特生物科技有限公司；1，8-二羥基蒽醌(批號110829-9702)和荷葉堿(批號111566-201304)，均購自中國食品藥品檢定研究院。AB-8、S-8、NKA-9、X-5和D4020型大孔吸附樹脂均購自天津南開大學(xué)化工廠。乙腈和甲醇(色譜純，德國Sigma-Aldrich公司)；乙醇、環(huán)己烷、鹽酸、氨水和氯仿均為分析純，均購自北京化工廠；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1含量測定方法

2.1.1Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法測定總黃酮含量 取降脂寧有效部位5 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加體積分數(shù)為70%的乙醇溶解，定容至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液2 mL、蘆丁對照品溶液(取蘆丁對照品10 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加體積分數(shù)為70%的乙醇溶解，定容至刻度，搖勻)0.5和1.0 mL，分別置于10 mL試管中，加入質(zhì)量濃度為50 g·L-1的亞硝酸鈉0.3 mL，放置6 min，加入質(zhì)量濃度為100 g·L-1硝酸鋁0.3 mL，放置6 min，再加入質(zhì)量濃度為40 g·L-1氫氧化鈉4 mL，加水定容至刻度，搖勻，放置15 min，于510 nm處測定吸光度值，計算總黃酮的含量。

2.1.2醋酸鎂比色法測定總蒽醌的含量 取降脂寧有效部位6 mg，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，加環(huán)己烷30 mL以及216 mL·L-1的鹽酸15 mL，回流水解2 h，靜置分層，殘渣用環(huán)己烷洗滌3次，合并濾液及洗液，回收溶劑，殘留物用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的氫氧化鈉 5 mL溶解，過濾，濾液用108 mL·L-1的鹽酸7 mL酸化，靜置15 min，過濾，沉淀用甲醇轉(zhuǎn)溶至10 mL量瓶中，搖勻。分別精密吸取上述溶液2 mL、1，8-二羥基蒽醌對照品溶液(取對照品6 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻)0.5和1.0 mL，分別置于10 mL試管中，加入質(zhì)量濃度為60 g·L-1的醋酸鎂甲醇溶液定容至刻度，搖勻。于510 nm處測定吸光度值，計算總蒽醌含量。

2.1.3溴甲酚綠比色法測定總生物堿含量 取降脂寧有效部位15 mg，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，加入氨水0.5 mL，氯仿25 mL，超聲提取(30 min，功率250 W，100 kHz)，放冷，濾過，濾渣用少量溶劑洗滌3次，合并濾液及洗液，回收溶劑，殘留物用甲醇轉(zhuǎn)溶至10 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液2 mL，荷葉堿對照品溶液(取荷葉堿對照品8 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻)0.4和0.8 mL，分別置于10 mL試管中，加入氯仿6 mL，密塞，劇烈振搖2 min，移至分液漏斗中，精密加入pH值為5.0的溴甲酚綠溶液4 mL，搖勻，靜置。取澄清的氯仿溶液，于414 nm處測定吸光度值，計算總生物堿含量。

2.1.4HPLC法測定SBGC的含量 色譜柱：Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(18∶82)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：320 nm；柱溫：室溫。

精密吸取SBGC對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.011 34 mg·mL-1)4，8，12，16和20 μL，注入液相色譜儀，測定色譜峰峰面積，以SBGC對照品的進樣量對色譜峰峰面積進行回歸，得回歸方程：y=4 106 268.58x+5 908.81，r=0.999 1。

取降脂寧有效部位9 mg，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，加入體積分數(shù)為50%的乙醇溶液25 mL，超聲提取(30 min，功率250 W，100 kHz)，放冷，濾過，濾渣用少量溶劑洗滌3次，合并濾液及洗液，回收溶劑，殘留物用甲醇轉(zhuǎn)溶至10 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻。分別精密吸取SBGC對照品溶液和樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，計算含量。

2.2降脂寧有效部位提取工藝 分別以Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法測定總黃酮含量、醋酸鎂比色法測定總蒽醌含量、溴甲酚綠比色法測定總生物堿含量和HPLC法測定SBGC含量，在單因素實驗基礎(chǔ)上，選擇L9(34)正交表，以總黃酮、總蒽醌、總生物堿以及SBGC的提取率為評價指標，考察提取溶劑、溶劑用量、提取時間和提取次數(shù)對提取效果的影響，優(yōu)選降脂寧有效部位最佳提取工藝。綜合分析結(jié)果表明，提取溶劑、溶劑用量、提取時間和提取次數(shù)均有顯著性影響，結(jié)合生產(chǎn)實際情況與節(jié)約成本綜合考慮，確定降脂寧有效部位的最佳提取工藝為：按照處方比例稱取藥材，加10倍量體積分數(shù)為70%的乙醇提取3次，每次1.5 h，各評價指標的提取率均達到90%左右。

2.3降脂寧有效部位純化工藝 分別以Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法測定總黃酮含量、醋酸鎂比色法測定總蒽醌含量、溴甲酚綠比色法測定總生物堿含量和HPLC法測定SBGC含量，通過單因素實驗，以總黃酮、總蒽醌、總生物堿以及SBGC的吸附量、吸附-解吸率及其在洗脫物中的含量作為評價指標，篩選降脂寧有效部位的最佳純化工藝。

2.3.1大孔樹脂預(yù)處理 分別取適量AB-8、S-8、NKA-9、X-5和D4020型大孔吸附樹脂在乙醇中浸泡12 h，濕法裝柱后乙醇沖洗至流出液與水混合(1∶5)不呈現(xiàn)白色混濁；再用蒸餾水沖洗至流出液無醇味，備用。

2.3.2上樣液的制備 按照正交實驗結(jié)果得到的最佳提取工藝操作，即按照處方比例稱取山楂500 g，決明子25 g，荷葉75 g，制何首烏25 g，加10倍量體積分數(shù)為70%的乙醇提取3次，每次1.5 h，過濾，減壓回收溶劑至無醇味，得降脂寧提取物，加10倍量水超聲分散溶解，以降脂寧藥材計，溶液質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1，離心，取上清液，即得。

2.3.3大孔樹脂的篩選 取已處理好的5種大孔樹脂各30 mL，分別裝柱(徑高比為1∶11)，將上樣液以2 BV· h-1的流速分別通過樹脂床，間隔10 mL收集流出液，分別監(jiān)測總黃酮(Al(NO3)3-NaNO2-NaOH顯色反應(yīng))、總蒽醌(醋酸鎂顯色反應(yīng))、總生物堿(點于硅膠G板，碘化鉍鉀顯色)以及SBGC(點于硅膠G板，硫酸乙醇顯色)的泄漏點。吸附完成后，先用蒸餾水洗脫5 BV除雜，再用體積分數(shù)為50%的乙醇洗脫，至洗脫液近無色為止，收集洗脫液，回收溶劑，得洗脫物。取洗脫物適量，按照2.1項下方法操作，計算各評價指標，篩選樹脂類型。結(jié)果見表1。

表1不同型號大孔吸附樹脂篩選

Tab.1 Screening of different types of micro-porous resins

指標 樹脂類型AB?8S?8NKA?9X?5D?4020總黃酮吸附量/mg451．31481．40210．61361．05191．16吸附?解析率/%95．9526．0569．2083．8196．09含量/%41．4843．3783．9661．8320．30總蒽醌吸附量/mg19．8421．179．2615．875．29吸附?解析率/%75．7634．4268．8084．3085．05含量/%1．442．523．673．000．79總生物堿吸附量/mg3．723．971．742．980．99吸附?解析率/%36．1327．8247．7593．5857．25含量/%0．130．380．480．630．10SBGC吸附量/mg7．247．733．385．791．93吸附?解析率/%46．3444．8638．3780．2344．15含量/%0．321．200．751．040．15

由表1中最大吸附量可知，D-4020和NKA-9型樹脂吸附性較差；由吸附-解吸率可知，AB-8型樹脂對總黃酮的吸附-解析率最高，X-5型樹脂對總生物堿以及SBGC的吸附-解析率最高，X-5和D-4020型樹脂對總蒽醌的吸附-解析率相差不大且優(yōu)于其他樹脂，結(jié)合洗脫物中總黃酮、總蒽醌、總生物堿以及SBGC的含量綜合考慮，確定X-5型大孔吸附樹脂作為降脂寧有效部位純化用樹脂。

2.3.4上樣液濃度考察 取已處理好的X-5型大孔樹脂30 mL，裝柱(徑高比為1∶11)，取一系列相同體積不同質(zhì)量濃度(0.05，0.1和0.15 g·mL-1)的上樣液，以相同流速2 BV·h-1分別通過樹脂柱，進行動態(tài)吸附。以Al(NO3)3-NaNO2-NaOH顯色反應(yīng)監(jiān)測泄漏點(通過檢識，發(fā)現(xiàn)總蒽醌、總生物堿以及SBGC在總黃酮泄漏后開始泄露，故以總黃酮的泄露點進行監(jiān)測)，記錄上樣量，計算總黃酮、總蒽醌、總生物堿以及SBGC的吸附量。結(jié)果顯示，上樣液質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1時，X-5型樹大孔脂對降脂寧總黃酮、總蒽醌、總生物堿以及SBGC的吸附量較大，故最佳上樣液質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1。

2.3.5吸附流速的考察 取已處理好的X-5型大孔樹脂30 mL，裝柱(徑高比為1∶11)，取上樣液，分別以2，4和6 BV·h-1的流速通過樹脂柱，以Al(NO3)3-NaNO2-NaOH顯色反應(yīng)監(jiān)測泄漏點，記錄上樣量，計算總黃酮、總蒽醌、總生物堿以及SBGC的被吸附量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著吸附流速的增加，樹脂對降脂寧總黃酮、總蒽醌、總生物堿以及SBGC的吸附量明顯減少，當吸附流速增加到6 BV·h-1時，降脂寧有效成分與樹脂之間的吸附力較差，吸附流速為2和4 BV·h-1時，吸附能力無明顯差別，故確定吸附流速以4 BV·h-1為宜。

2.3.6樹脂柱徑高比考察 分別取已處理好的X-5型大孔樹脂19，24.5和30 mL，裝柱，徑高比分別為 1∶7，1∶9和1∶11，取上樣液，以4 BV·h-1的流速通過樹脂柱，以Al(NO3)3-NaNO2-NaOH顯色反應(yīng)監(jiān)測泄漏點，記錄上樣量，計算總黃酮、總蒽醌、總生物堿以及SBGC的吸附量。待吸附完成后，按照2.3.3項下操作，計算各評價指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從被吸附量和吸附-解吸率兩方面考慮，徑高比1∶9組和1∶11組(各指標吸附-解吸率在80%以上)均優(yōu)于徑高比1∶7組(各指標吸附-解吸率在65%左右)，徑高比1∶9組略優(yōu)于1∶11組，但差異不顯著；從洗脫物含量考慮，徑高比1∶9組較好，故確定樹脂柱徑高比為1∶9。

2.3.7泄露曲線考察 取已處理好的X-5型大孔樹脂24.5 mL，裝柱(徑高比1∶9)，取上樣液，以4 BV·h-1的流速連續(xù)通過樹脂柱，每10 mL接收一次流出液，Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法測定每份流出液總黃酮的質(zhì)量濃度，以流份份數(shù)與總黃酮質(zhì)量濃度(mg·mL-1)作圖，結(jié)果見圖1。

圖1X-5大孔吸附樹脂吸附總黃酮的動態(tài)曲線

Fig.1 Dynamic absorption curve of total flavoneson X-5 macro-porous resin

由圖1可知，在上述吸附條件下，第10個流份，即上樣量為100 mL時，總黃酮開始泄漏，但在總黃酮吸附-解析率達到一定要求的前提下，為提高樹脂利用率，需要對樹脂最大上樣量進行進一步考察。

2.3.8最大上樣量考察 取已處理好的X-5型大孔樹脂24.5 mL，裝柱(徑高比1∶9)，分別取上樣液100，110，130和150 mL，以4 BV·h-1的流速通過樹脂柱，待吸附完成，按照2.3.3項下操作，測定總黃酮含量，計算總黃酮吸附-解析率。結(jié)果見表2。

表2不同體積上樣液經(jīng)大孔處理結(jié)果

Tab.2 The purification effect of different valumes of sample

上樣量/mL總黃酮含量/%總黃酮吸附?解析率/%10062．8684．0511068．7290．0113066．6487．4715064．7686．60

由表2可知，上樣量為110 mL時總黃酮吸附-解析率最高，洗脫物中總黃酮含量也較高，隨著上樣量繼續(xù)增加，總黃酮含量及其吸附-解析率也隨之下降。因此，確定最大上樣量為110 mL(4.5 BV)，即樹脂比吸附量(以總黃酮計)為13.51 mg·mL-1。

2.3.9水除雜體積考察 取已處理好的X-5型大孔樹脂24.5 mL，裝柱(徑高比1∶9)，取上樣液110 mL，以4 BV·h-1的流速通過樹脂柱，待吸附完成后，樹脂柱分別用蒸餾水洗脫3，5和7 BV后，按照2.3.3項下操作，計算各評價指標。結(jié)果顯示，當采用5 BV水體積進行洗脫時，各指標成分吸附-解吸率和含量均較優(yōu)。即采用5倍量樹脂柱體積水清洗樹脂床既有利于有效地去除雜質(zhì)，又能較好地保留有效物質(zhì)。

2.3.10洗脫溶劑的考察 取已處理好的X-5型大孔樹脂24.5 mL，裝柱(徑高比1∶9)，取上樣液110 mL，以4 BV·h-1的流速通過樹脂柱，待吸附完成后，樹脂柱用蒸餾水洗脫5 BV后，再分別用體積分數(shù)為50%，70%和90%的乙醇洗脫至洗脫液近無色，洗脫流速為2 BV·h-1，分別收集洗脫液后，按照2.3.3項下操作，計算各評價指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用體積分數(shù)為50%的乙醇洗脫時，洗脫物中各指標的吸附-解析率均在80%以上，含量高于體積分數(shù)為70%和90%的乙醇洗脫，故確定采用體積分數(shù)為50%的乙醇作為洗脫溶劑。

2.3.11洗脫流速的考察 取已處理好的X-5型大孔樹脂24.5 mL，裝柱(徑高比1∶9)，取上樣液110 mL，以4 BV·h-1的流速通過樹脂柱，待吸附完成后，樹脂柱先用蒸餾水洗脫5 BV進行除雜，再用體積分數(shù)為50%的乙醇洗脫至洗脫液近無色，洗脫流速分別控制為2，4和6 BV·h-1，分別收集洗脫液，按照2.3.3項下操作，計算各成分吸附-解吸率。結(jié)果顯示，洗脫流速為4和6 BV·h-1時，各成分含量及吸附-解析率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且均優(yōu)于2 BV·h-1。因此，結(jié)合生產(chǎn)實際情況與節(jié)約成本綜合考慮，確定洗脫流速為4 BV·h-1。

2.3.12洗脫曲線考察 取已處理好的X-5型大孔樹脂24.5 mL，裝柱(徑高比1∶9)，取上樣液110 mL，以4 BV·h-1的流速通過樹脂柱，待吸附完成后，樹脂柱先用蒸餾水洗脫5 BV進行除雜，再用體積分數(shù)為50%的乙醇洗脫，洗脫流速為4 BV·h-1。每20 mL收集1份洗脫液，回收溶劑后，按照2.1項下方法測定各成分質(zhì)量濃度。以洗脫液體積(mL)與質(zhì)量濃度(mg·mL-1)繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖2。

圖2總黃酮、總蒽醌和總生物堿及2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(SBGC)洗脫曲線

Fig.2 Elution curves of total flavones，total anthraquinones，total alkaloids and 2，3，5，4′-hydroxyphenyl-vinyl-2-O-β-D-glucoside

由圖2可知，當體積分數(shù)為50%的乙醇洗脫7 BV時，已基本將總黃酮、總蒽醌、總生物堿和SBGC洗脫完全，故確定洗脫劑用量為7 BV。

2.4工藝驗證 采用已確定的降脂寧有效部位最佳提取純化工藝條件，進行3批中試驗證，取降脂寧有效部位干浸膏適量，測定總黃酮、總蒽醌、總生物堿以及SBGC的含量。結(jié)果見表3。以各成分含量的可重復(fù)性評價工藝的適用性。結(jié)果表明，該提取純化工藝合理、穩(wěn)定。

表3不同批次樣品經(jīng)大孔樹脂處理結(jié)果

Tab.3 The purification effect of different batches of samples

批次指標含量/%總黃酮總蒽醌總生物堿SBGC164．493．400．651．14261．293．290．631．12359．233．090．601．01

3 討論

降脂寧由4味中藥組成，其化學(xué)成分類型復(fù)雜、數(shù)量眾多，為了更全面地評價其有效部位的提取純化工藝，在指標的選擇上應(yīng)盡量考慮各藥材的有效成分。根據(jù)課題組前期研究結(jié)果表明[16]，該實驗選擇以總黃酮、總蒽醌、總生物堿及SBGC為指標成分。

本實驗以各指標成分的提取率作為評價指標，對降脂寧有效部位的提取工藝進行研究，在單因素實驗基礎(chǔ)上結(jié)合正交實驗確定了最佳提取工藝：加10倍量體積分數(shù)為70%的乙醇提取3次，每次1.5 h。該提取工藝較原來相比簡化了工藝步驟，節(jié)約了時間，且各指標成分的提取率均有所提高。

近年來，隨著對中藥及天然藥物活性成分及有效部位相關(guān)研究的增多，大孔吸附樹脂在分離、純化中的應(yīng)用也越來越多[17]，并取得了較理想的效果，尤其是在黃酮類[18-19]、生物堿類[19-20]和皂苷類[20]的純化應(yīng)用方面。本實驗對降脂寧有效部位的純化工藝進行了研究，經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)X-5型大孔樹脂的綜合吸附性能較好，其最佳純化工藝為：上樣液質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1，吸附流速為4 BV·h-1，上樣量以總黃酮計為13.51 mg·mL-1，樹脂徑高比為1∶9，蒸餾水5 BV洗脫除雜，體積分數(shù)為50%的乙醇7 BV洗脫富集降脂寧有效部位，洗脫流速為4 BV·h-1。在純化工藝考察過程中，為避免上樣液中的不溶物堵塞樹脂，對上樣液采用了離心操作。

按照最佳提取純化工藝富集純化后，降脂寧有效部位中總黃酮類成分的含量能達到60%左右，總蒽醌含量能達到3%以上，總生物堿含量能達到0.6%以上，SBGC含量能達到1%以上。經(jīng)驗證，該工藝穩(wěn)定、可行，重復(fù)性較好。另外，實驗中所用大孔吸附樹脂可重復(fù)使用，成本低且快速、高效、低毒，適合實際生產(chǎn)，為降脂寧的進一步開發(fā)應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。

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