Notch信號途徑對放療后骨髓譜系造血重建的影響及其機制

陳娟娟，周思朗，夏鴛鴦，趙永星，陳永樂，黃斯勇，吳必嘉

(1 中國人民解放軍第四二一醫(yī)院，廣州510318；2 西安高新醫(yī)院)

高度保守的Notch信號途徑是造血調(diào)控最為關(guān)鍵的信號途徑之一，需要通過相鄰細胞間Notch受體與配體直接接觸才能被激活[1，2]。造血細胞和造血微環(huán)境分別高表達Notch受體和Notch配體，這為干預(yù)造血重建提供了新思路[3]。目前已發(fā)現(xiàn)的5種Notch配體均具有擴增造血干細胞的生物學(xué)效應(yīng)，尤其是Delta-like 1[4]。造血微環(huán)境中骨髓竇狀內(nèi)皮細胞是造血干細胞維穩(wěn)和應(yīng)激調(diào)控的重要結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)[5,6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在生理狀態(tài)下Notch信號依賴內(nèi)皮細胞促進造血干細胞體外擴增[7]。但目前尚無放療等病理狀態(tài)下Notch信號調(diào)控造血失穩(wěn)態(tài)和譜系重建的體內(nèi)研究[8,9]。2014年1月～2017年1月，我們利用骨髓造血細胞特異性敲除Notch信號關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-J的轉(zhuǎn)基因小鼠以及重組蛋白D1R激活Notch信號的野生型小鼠建立γ射線放療模型，觀察了Notch信號途徑對放療后造血重建和譜系重塑的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 RBP-Jflox/+轉(zhuǎn)基因C57/B6小鼠8只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由日本京都大學(xué)Tasuku Honjo教授饋贈。MxCre轉(zhuǎn)基因C57/B6小鼠8只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自南京大學(xué)模式動物研究所。雄性C57/B6小鼠42只，8周齡，體質(zhì)量20～22 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。所有動物于SPF級實驗動物房飼養(yǎng)，自由攝食及飲水，光照12 h明暗交替。主要儀器：60鈷源(60Co-γ)，第四軍醫(yī)大學(xué)輻照中心；倒置顯微鏡，德國Leica公司；FACScalibur流式細胞儀，美國BD公司；激光共聚焦顯微鏡，日本Olympus公司；化學(xué)發(fā)光成像儀，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。主要試劑及抗體：Notch配體重組蛋白D1R，本課題組自主研發(fā)；聚肌胞苷酸(poly：I-C)，德國Sigma公司；APC標(biāo)記的抗小鼠Lin抗體、FITC標(biāo)記的抗小鼠CD3ε抗體，美國BD公司；FITC標(biāo)記的抗小鼠Sca-1抗體，美國eBioscience公司；PE標(biāo)記的抗小鼠c-Kit抗體、FITC標(biāo)記的抗小鼠Ly-6G抗體、APC標(biāo)記的抗小鼠CD11b抗體、APC標(biāo)記的抗小鼠CD45R/B220抗體，美國Biolegend公司；兔源抗ICN1抗體，英國Abcam公司；Cy3標(biāo)記的抗兔IgG抗體，武漢博士德生物工程有限公司；HRP標(biāo)記的抗兔IgG抗體，德國Sigma公司；Anti-Ly-6G MicroBead Kit、Anti-CD11b MicroBead Kit，德國Miltenyi公司；兔抗小鼠PI3K抗體，美國Cell Signaling公司。

1.260Co-γ射線電離輻照對Notch信號敲除小鼠生存狀態(tài)及造血重建影響的觀察

1.2.1 Notch信號敲除小鼠模型建立 選擇4只雌性MxCre轉(zhuǎn)基因C57/B6小鼠、2只雄性RBP-Jflox/+轉(zhuǎn)基因C57/B6小鼠，按雌雄比2∶1分成兩籠并交配，獲得第2代MxCre+RBP-Jflox/+小鼠9只(雌鼠6只、雄鼠3只)，飼養(yǎng)至8周齡，按雌雄比2∶1分成三籠并交配，獲得第3代骨髓造血細胞特異性敲除Notch信號經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子RBP-J的雙轉(zhuǎn)基因MxCre+RBP-Jflox/flox小鼠18只(敲除組)和未敲除MxCre+RBP-Jflox/+對照小鼠18只(未敲除組)。兩組飼養(yǎng)至5周齡，腹腔注射IFN-α誘生劑poly：I-C 300 μg，隔日1次，注射4次；之后每周注射1次，注射2次。共注射6次。

1.2.260Co-γ射線電離輻照 將上述行poly：I-C誘導(dǎo)小鼠飼養(yǎng)至8周齡，均接受全身一次性60Co-γ射線亞致死劑量600 cGy電離輻照，皮源距60 cm，吸收劑量率為156.44 cGy/min。

1.2.3 觀察指標(biāo) ①生存狀態(tài)：電離輻照后，每日早晚觀察1次，記錄小鼠精神、行為、毛發(fā)等改變，統(tǒng)計電離輻照第14天的死亡率。②造血重建情況：a.造血細胞形態(tài)：兩組電離輻照第7天，取鼠尾血，載玻片常規(guī)推片；戊巴比妥鈉麻醉后，取雙側(cè)股骨和脛骨骨髓細胞，載玻片常規(guī)推片；室溫下瑞氏-吉姆薩染色15 min，流水沖洗約30 s，晾干，倒置顯微鏡下觀察細胞數(shù)目、種類和形態(tài)。b.細胞免疫表型：兩組電離輻照第7天，取骨髓、脾臟和眼球血細胞，紅細胞裂解液裂紅，300目尼龍膜過濾，洗滌，25%大鼠血清4 ℃封閉10 min，分別加入造血干/祖細胞抗體(Lin、Sca-1、c-Kit)、髓系細胞抗體(Ly6G、CD11b)、B淋巴細胞抗體(B220)、T淋巴細胞抗體(CD3ε)，4 ℃避光孵育20 min，流式液洗滌2遍，300目尼龍膜二次過濾，流式液重懸，置于冰上備用。上機前加入PI染液，F(xiàn)ACScalibur流式細胞儀檢測細胞免疫表型，F(xiàn)lowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.360Co-γ射線電離輻照后激活小鼠Notch信號對造血重建影響的觀察

1.3.1 Notch信號激活小鼠模型建立及60Co-γ射線電離輻照 取8周齡C57/B6雄鼠12只，隨機分為激活組、未激活組，每組6只。兩組均接受全身一次性60Co-γ射線亞致死劑量600 cGy電離輻照，皮源距60 cm，吸收劑量率為156.44 cGy/min。輻照后2 h，激活組腹腔注射Notch信號激活劑重組蛋白D1R 4 mg/kg，未激活組腹腔注射等體積PBS，之后每24 h腹腔注射1次，連續(xù)注射7天。

1.3.2 觀察指標(biāo) ①重組蛋白D1R的體內(nèi)活性：兩組電離輻照第7天，戊巴比妥鈉麻醉，完整剝離股骨，EDTA脫鈣液37 ℃孵箱脫鈣21天，OCT包埋，10 μm厚切片。1% BSA室溫封閉30 min，兔源抗ICN1一抗4 ℃孵育12 h，Cy3標(biāo)記的抗兔IgG二抗室溫避光孵育2 h，1∶10 000稀釋Hoechst 33258染細胞核15 min，50%甘油PBS封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并采圖。②造血重建情況：兩組電離輻照第7天，取骨髓、脾臟和眼球血細胞，F(xiàn)ACScalibur流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowJo軟件分析數(shù)據(jù)。方法同1.2.3。③髓系前體細胞周期：兩組電離輻照第7天，戊巴比妥鈉麻醉，取股骨和脛骨骨髓細胞，紅細胞裂解液裂紅，300目尼龍膜過濾，洗滌，25%大鼠血清4 ℃封閉10 min，加入Ly6G和CD11b抗體，4 ℃避光孵育20 min；流式液洗滌，300目尼龍膜過濾，70%乙醇4 ℃固定30 min；流式液洗滌并重懸，上機前加入PI染液，F(xiàn)ACScalibur流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowJo軟件分析數(shù)據(jù)。④髓系前體細胞增殖信號通路：兩組電離輻照第7天，戊巴比妥鈉麻醉，取股骨和脛骨骨髓細胞，磁珠分選Ly6G+CD11b+細胞。RIPA∶PMSF=100∶1充分裂解細胞，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，留取上清液，加入100 μg/15 μL蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min，使蛋白充分變性。然后行SDS-PAGE，200 mA穩(wěn)定電流濕法轉(zhuǎn)膜3 h，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PMSF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉液室溫?fù)u床封閉2 h；加入兔抗小鼠PI3K一抗，4 ℃孵育12 h；室溫洗膜4次，加入HRP標(biāo)記的抗兔IgG二抗，室溫避光孵育2 h；洗膜，Millipore發(fā)光液發(fā)光，化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4 重組蛋白D1R激活電離輻照小鼠Notch信號對組織器官毒性作用觀察 取8周齡C57/B6雄鼠18只，隨機分為陰性對照組、D1R組、陽性對照組，每組6只。D1R組和陽性對照組均接受600 cGy60Co-γ射線電離輻照，陰性對照組不接受電離輻照。輻照后2 h，D1R組腹腔注射重組蛋白D1R 4 mg/kg，陽性對照組腹腔注射等體積PBS，方法同1.3.1。停藥3個月，戊巴比妥鈉麻醉，取心、肝、脾、肺、腎、胰，計算脾/體質(zhì)量和肝/體質(zhì)量，行HE染色，觀察組織細胞形態(tài)；取股骨和脛骨骨髓以及外周血單個核細胞，按1.2.3中方法行流式細胞術(shù)檢測骨髓造血干/祖細胞以及骨髓和外周血髓系細胞。

2 結(jié)果

2.1 電離輻照對Notch信號敲除小鼠生存狀態(tài)及造血重建的影響 ①生存狀態(tài)：兩組電離輻照后均出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，攝食減少、體質(zhì)量下降，毛色晦暗。敲除組上述癥狀更為嚴(yán)重，且有2只出現(xiàn)放射性腦病癥狀。電離輻照第14天，未敲除組死亡6只，敲除組死亡12只，兩組比較P<0.05。②有核細胞形態(tài)學(xué)變化：與未敲除組比較，敲除組骨髓和外周血有核細胞、造血干/祖細胞和髓系細胞數(shù)量明顯減少，但形態(tài)正常。③各造血譜系細胞變化：見表1。

2.2 激活Notch信號對電離輻照小鼠造血重建的影響 ①重組蛋白D1R的體內(nèi)活性：電離輻照第7天，與未激活組比較，激活組骨髓造血細胞Notch信號活化片段ICN1的核表達增多，Notch信號明顯激活。②各造血譜系細胞變化：見表2。③髓系前體Ly6G+CD11b+細胞周期變化：見表3。④PI3K蛋白表達：未激活組與激活組PI3K蛋白相對表達量分別為0.26±0.05、0.82±0.16，兩組比較P<0.01。

表1 未敲除組與敲除組電離輻照第7天各造血譜系細胞變化

注：LSK為Lin-Sca-1+c-Kit+造血干/祖細胞；與未敲除組比較，*P<0.05，#P<0.01。

表2 未激活組與激活組電離輻照第7天各造血譜系細胞變化

注：與未激活組比較，*P<0.05，#P<0.01。

表3 未激活組與激活組髓系Ly6G+CD11b+細胞周期變化

注：與未激活組比較，*P<0.01。

2.3 重組蛋白D1R激活電離輻照小鼠Notch信號對組織器官的毒性作用 停藥3個月，三組心、肝、脾、肺、腎、胰組織HE染色，細胞形態(tài)和組織構(gòu)架差別不明顯。三組脾/體質(zhì)量、肝/體質(zhì)量及骨髓和外周血各造血譜系細胞變化見表4。

3 討論

血液腫瘤和實體瘤的傳統(tǒng)治療以手術(shù)、放療、化療和造血干細胞移植為主。約50%實體瘤及80%血液腫瘤在治療過程中會發(fā)生急慢性造血功能抑制，近10%患者死于骨髓耗竭及全血細胞減少誘發(fā)的嚴(yán)重感染、出血等并發(fā)癥[10]。放化療相關(guān)的骨髓毒性反應(yīng)和造血微環(huán)境損害存在難以復(fù)原的特點，容易導(dǎo)致造血恢復(fù)延遲、化療周期脫落、自體移植動員困難等，目前臨床上缺乏應(yīng)對良策。傳統(tǒng)造血生長因子主要通過刺激造血祖細胞增殖和分化，提升白細胞、血小板、血紅蛋白等指標(biāo)，存在過度刺激、提前消耗造血潛能以及促進腫瘤生長等隱患[11]。目前，骨髓應(yīng)激損傷時造血干細胞與造血微環(huán)境失穩(wěn)或重塑的細胞和分子機制尚不清楚，這為放化療及造血干細胞移植相關(guān)急慢性造血功能抑制的新藥研發(fā)帶來困難。

表4 停藥3個月陰性對照組、陽性對照組及D1R組骨髓和外周血各造血譜系細胞及脾/體質(zhì)量、肝/體質(zhì)量變化

注：與陰性對照組比較，*P<0.05，#P<0.01；與陽性對照組比較，△P<0.05，▽P<0.01。

研究顯示，造血的動態(tài)平衡依賴于造血干細胞自身(如表面受體、信號通路等)和造血微環(huán)境(如基質(zhì)細胞、細胞因子、黏附分子等)的精細調(diào)控[12，13]。作為造血微環(huán)境的重要支架細胞，骨髓竇狀內(nèi)皮細胞所表達的受體、配體、細胞因子、黏附分子和血管內(nèi)分泌因子等是維持造血穩(wěn)態(tài)和重建的必需條件[14]。Notch信號途徑是調(diào)控造血干細胞胚胎發(fā)育、“干性”維持及體外擴增的關(guān)鍵信號[15]，也是維系血管內(nèi)皮細胞發(fā)育和功能的重要信號[16，17]，不僅參與造血維穩(wěn)[18]，還可能調(diào)控造血失穩(wěn)。本研究利用雙轉(zhuǎn)基因小鼠特異性敲除Notch信號的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-J，發(fā)現(xiàn)骨髓造血細胞Notch信號缺失使小鼠放療相關(guān)死亡增加，造血干/祖細胞重建受阻，髓內(nèi)外多系尤其是髓系重建障礙，不利于放療小鼠造血功能的早期恢復(fù)。提示Notch信號途徑在放療后造血重建過程中可能發(fā)揮正向調(diào)控作用。

失穩(wěn)態(tài)下竇狀內(nèi)皮細胞表達多種Notch受體和配體調(diào)控造血重建，目前關(guān)于Jagged1、Delta-like 1、Jagged2的研究最多。但Notch信號激活新藥研發(fā)的難點在于無法準(zhǔn)確介導(dǎo)受體和配體胞外段的內(nèi)吞，不能完美暴露酶切位點，故藥物活性欠佳。本課題組前期自主研發(fā)的高純度新型Notch配體重組蛋白D1R具有靶向錨定內(nèi)皮細胞、激活Notch信號途徑的生物學(xué)特性[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組蛋白D1R具有外源性激活造血龕內(nèi)造血細胞經(jīng)典Notch信號途徑的生物學(xué)活性，可促進骨髓抑制小鼠早期造血重建，內(nèi)源性擴增造血干/祖細胞，尤其有利于髓系細胞的譜系重塑，提高機體免疫力。該效應(yīng)具有劑量相關(guān)性，低劑量無效，中劑量效果最佳，高劑量次之，這可能與Notch信號的激活依賴于受體和配體的相互作用有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，重組蛋白D1R可激活放療小鼠髓系前體細胞Notch信號下游的PI3K信號通路，繼而推進細胞周期進程。但既往研究報道，Notch信號負(fù)性調(diào)控骨髓增殖性腫瘤[19，20]，本研究結(jié)果與其相悖，這可能與體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相關(guān)，尚需進一步研究。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電離輻照對小鼠骨髓造成了慢性損傷，其遠期造血重建能力受損；重組蛋白D1R可顯現(xiàn)出良好的長期保護造血干細胞和髓系細胞的生物學(xué)作用；Notch激活小鼠未出現(xiàn)實體瘤、血液腫瘤等疾病的病理表現(xiàn)和癥狀體征，初步排除了D1R誘發(fā)二次腫瘤的可能性。提示短期激活Notch信號途徑能長期安全維系放療后造血重建，對接受放化療或造血干細胞移植的惡性腫瘤患者具有重要意義。

Notch信號可在T、B淋巴細胞分化選擇方面發(fā)揮重要作用，能決定著脾臟邊緣帶和濾泡B淋巴細胞的作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，Notch敲除小鼠的脾臟B淋巴細胞減少，Notch激活小鼠的脾臟和外周血B淋巴細胞均升高，這些變化具有一過性，可能與髓系大量增殖、代償性抑制淋系分化有關(guān)，其具體機制有待于深入研究。

綜上所述，Notch信號途徑在造血重建中具有正向調(diào)控作用；本研究通過局部靶向造血微環(huán)境富集治療，動態(tài)觀察了Notch信號途徑參與放療后造血維穩(wěn)的體內(nèi)過程，并初步探討了細胞和分子學(xué)機制，為骨髓抑制防控藥物的研發(fā)提供了新思路。

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