靶向線粒體的mt-roGFP2熒光探針檢測(cè)人肝癌HepG2細(xì)胞線粒體ROS水平動(dòng)態(tài)變化

劉曉寧，薄惠，劉翠娥

(黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，鄭州450063)

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系HepG2、人腎上皮細(xì)胞系293T(以下分別稱HepG2細(xì)胞、293T細(xì)胞)，購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。mt-roGFP2質(zhì)粒載體pLPCX，由Tobias P. Dick教授惠贈(zèng)。所有引物由本課題組自行設(shè)計(jì)，委托中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院合成。MitoTracker?紅色線粒體熒光探針、Lipofectamine?2000，美國(guó)Invitrogen公司；青鏈霉素混合液(P/S)、H2O2、DTT，北京索萊寶科技有限公司；聚凝胺、嘌呤霉素，美國(guó)Sigma公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒，北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ-HF、Xba Ⅰ，美國(guó)NEB公司；PCR擴(kuò)增試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；無(wú)縫克隆試劑盒、pLenti-CMV-PGK-puro、pVSVg、pRev、pGag-Pol，上海和元生物技術(shù)股份有限公司；GAPDH一抗、GFP一抗，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗，美國(guó)Santa-Cruz公司。

1.2 pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro慢病毒載體構(gòu)建 以pLPCX為模板，設(shè)計(jì)正向引物5′-CGAGC-TCAAGCTGAATTCGCCACCATGGCCTCCACTCGTGT C-3′和反向引物5′-CGGTAGAATTATCTAGATTACT-TGTACAGCTCGTCC-3′，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到mt-roGFP2目的片段。用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ-HF和Xba Ⅰ酶切載體pLenti-CMV-PGK-puro后，瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒回收，通過(guò)無(wú)縫克隆試劑盒將目的片段與回收載體連接，得到目的質(zhì)粒pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro。利用正向引物5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′和反向引物5′-CAGCGGGGCTGCTAAAGCGCATGC-3′對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒定。經(jīng)鑒定，目的片段已成功構(gòu)建入載體中。

1.3 mt-roGFP2慢病毒制備及其滴度測(cè)定 利用Lipofectamine?2000將慢病毒載體pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro與包裝質(zhì)粒pVSVg、pRev、pGag-Pol共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，離心，留取上清液，即mt-roGFP2慢病毒顆粒。為確定制備的慢病毒顆粒感染細(xì)胞最佳濃度，將所得慢病毒懸液梯度稀釋后再次感染293T細(xì)胞，再次檢測(cè)慢病毒滴度。共檢測(cè)3次，取平均值。慢病毒滴度(IU/mL)=(C×N×D×1 000)/V，其中C為每基因組整合的病毒拷貝數(shù)、N為感染時(shí)細(xì)胞數(shù)目、D為病毒載體稀釋倍數(shù)、V為稀釋病毒體積(μL)。

1.4 穩(wěn)定細(xì)胞株篩選 將HepG2細(xì)胞接種于含10% FBS和P/S的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，待細(xì)胞收縮變圓，加入適量培養(yǎng)液，制成密度為4×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液接種于24孔板，每孔500 μL，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，每孔加入上述制備的mt-roGFP2慢病毒顆粒0.99 μL，再加入適量聚凝胺，使其終濃度為5 μg/mL。感染12 h，棄去原培養(yǎng)液，每孔加入2 mL新鮮的培養(yǎng)液。感染72 h，加入適量嘌呤霉素，使其終濃度為2 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2天更換1次含2 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)液。嘌呤霉素篩選約兩周，奧林巴斯IX71熒光顯微鏡(激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)507 nm)觀察mt-roGFP2表達(dá)，Western blotting法鑒定mt-roGFP2表達(dá)。將穩(wěn)定表達(dá)mt-roGFP2的HepG2細(xì)胞命名為HepG2-mt-roGFP2。

1.5 mt-roGFP2熒光探針的亞細(xì)胞定位分析 選擇HepG2-mt-roGFP2細(xì)胞，接種于含10% FBS和P/S的DMEM完全培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取細(xì)胞2×104個(gè)接種于Nest-35 mm激光共聚焦培養(yǎng)皿，與MitoTracker線粒體熒光探針(終濃度為100 nmol/L)共溫育20 min。使用奧林巴斯FV1000激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)光波長(zhǎng)579 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)599 nm)觀察mt-roGFP2熒光探針的亞細(xì)胞定位。

1.6 線粒體ROS的熒光成像分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2-mt-roGFP2細(xì)胞接種于Nest-35 mm激光共聚焦培養(yǎng)皿，置于顯微鏡用活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中。采用尼康A(chǔ)1R激光掃描共聚焦顯微鏡拍攝同一細(xì)胞，在拍攝20 s時(shí)經(jīng)0.5 mmol/L H2O2處理，200 s時(shí)加入1 mmol/L DTT。設(shè)置2個(gè)激發(fā)光波長(zhǎng)(405、488 nm)和1個(gè)發(fā)射光波長(zhǎng)(500～554 nm)。通過(guò)Image J軟件分析熒光圖片(http://rsb.info.nih.gov/ij/)，通過(guò)設(shè)定閾值得到偽彩色比值(405 nm/488 nm)圖片。

2 結(jié)果

2.1 mt-roGFP2慢病毒滴度 mt-roGFP2表達(dá)載體與pVSVg、pRev和pGag-Pol共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生的mt-roGFP2慢病毒平均滴度為4.04×108IU/mL。見(jiàn)表1。

表1 mt-roGFP2慢病毒滴度

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞HepG2-mt-roGFP2構(gòu)建 mt-roGFP2慢病毒感染HepG2細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞HepG2-mt-roGFP2。經(jīng)熒光顯微鏡觀察和Western blotting法鑒定，roGFP2熒光蛋白探針?lè)€(wěn)定表達(dá)在HepG2細(xì)胞中，roGFP2熒光蛋白與MitoTracker探針共定位于HepG2細(xì)胞線粒體。

2.3 mt-roGFP2熒光探針響應(yīng)HepG2細(xì)胞線粒體ROS水平變化 合并后的熒光圖片(405 nm和488 nm)顯示，HepG2細(xì)胞線粒體經(jīng)歷了還原狀態(tài)到氧化狀態(tài)再到還原狀態(tài)的迅速轉(zhuǎn)換。外源性氧化劑H2O2的加入導(dǎo)致HepG2細(xì)胞線粒體ROS水平明顯升高，其熒光比值(405 nm/488 nm)從1.19上升到3.98，持續(xù)約135 s后加入還原劑DTT，可使其熒光比值下降至1.25。見(jiàn)圖1。

3 討論

作為細(xì)胞的“能量工廠”，線粒體利用氧氣進(jìn)行氧化磷酸化，產(chǎn)生三磷酸腺苷，為細(xì)胞及生命體提供能量；同時(shí)，伴隨著呼吸鏈電子泄露，線粒體成為ROS產(chǎn)生并相互轉(zhuǎn)化的主要位點(diǎn)。線粒體ROS在維持氧化還原平衡及參與細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控等方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。相比調(diào)控細(xì)胞內(nèi)整體ROS水平，調(diào)控線粒體ROS可能是一種更為有效的靶向治療腫瘤策略[4]。最近研究報(bào)道，靶向線粒體的熒光探針AIE-mito-TPP可選擇性聚集在腫瘤細(xì)胞線粒體內(nèi)，從而降低線粒體膜電位，增加線粒體ROS水平，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。因此，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)線粒體ROS水平對(duì)研究線粒體ROS在靶向治療腫瘤中的作用機(jī)制至關(guān)重要。

圖1 mt-roGFP2探針響應(yīng)H2O2和DTT引起的HepG2細(xì)胞線粒體ROS變化

熒光成像技術(shù)具有時(shí)空分辨率高、生物相容性好、敏感性高等優(yōu)勢(shì)，已成為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞及活體內(nèi)生物活性分子的有力工具。基于遺傳編碼的roGFP熒光探針通過(guò)巰基-二硫鍵轉(zhuǎn)換能實(shí)時(shí)成像顯示細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)變化，其最大特征是細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)由兩個(gè)激發(fā)光波長(zhǎng)的熒光比值表示，能降低光漂白作用、探針濃度差異、激光光源穩(wěn)定性、激發(fā)光路以及熒光在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間分布不一致等造成的實(shí)驗(yàn)誤差[17]。本研究應(yīng)用的mt-roGFP熒光探針是roGFP探針系列的一種，通過(guò)添加線粒體定位序列，將roGFP蛋白在HepG2細(xì)胞線粒體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體ROS水平的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、可逆性和特異性檢測(cè)和成像，為研究抗癌藥物所致線粒體ROS水平變化的研究提供了一個(gè)新方法。

綜上所述，靶向線粒體的roGFP2熒光探針能夠?qū)崟r(shí)動(dòng)態(tài)、可逆性地檢測(cè)HepG2細(xì)胞線粒體ROS水平變化并實(shí)時(shí)成像。這將為闡明氧化還原狀態(tài)變化在各種腫瘤細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程中的作用提供了一種新工具。

參考文獻(xiàn)：

[1] Gao X, Schottker B. Reduction-oxidation pathways involved in cancer development: a systematic review of literature reviews[J]. Oncotarget, 2017,8(31):51888-51906.

[2] Tochhawng L, Deng S, Pervaiz S, et al. Redox regulation of cancer cell migration and invasion[J]. Mitochondrion, 2013,13(3):246-253.

[3] Parri M, Chiarugi P. Redox molecular machines involved in tumor progression[J]. Antioxid Redox Signal, 2013,19(15):1828-1845.

[4] Zhang L, Wang K, Lei Y, et al. Redox signaling: potential arbitrator of autophagy and apoptosis in therapeutic response[J]. Free Radic Biol Med, 2015(89):452-465.

[5] Lei K, Tan S, Du W, et al. 3B, a novel of photosensitizer, exhibited anti-tumor effects via mitochondrial apoptosis pathway in MCF-7 human breast carcinoma cells[J]. Tumour Biol, 2015,36(7):5597-5606.

[6] Ezerina D, Morgan B, Dick TP. Imaging dynamic redox processes with genetically encoded probes[J]. J Mol Cell Cardiol, 2014(73):43-49.

[7] Kolossov VL, Hanafin WP, Beaudoin JN, et al. Inhibition of glutathione synthesis distinctly alters mitochondrial and cytosolic redox poise[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2014,239(4):394-403.

[8] Albrecht SC, Sobotta MC, Bausewein D, et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes[J]. J Biomol Screen, 2014,19(3):379-386.

[9] Galvan DL, Badal SS, Long J, et al. Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy[J]. Kidney Int, 2017,92(5):1282-1287.

[10] Hu Q, Gao M, Feng G, et al. Mitochondria-targeted cancer therapy using a light-up probe with aggregation-induced-emission characteristics[J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2014,53(51):14225-14229.

[11] Choi YJ, Choi YK, Lee KM, et al. SH003 induces apoptosis of DU145 prostate cancer cells by inhibiting ERK-involved pathway[J]. BMC Complement Altern Med, 2016，16(1):507.

[12] Choi YJ, Hur JM, Lim S, et al. Induction of apoptosis by deinoxanthin in human cancer cells[J]. Anticancer Res, 2014,34(4):1829-1835.

[13] Qiao J, Arthur JF, Gardiner EE, et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species[J]. Redox Biol, 2017(14):126-130.

[14] Su C, Shi A, Cao G, et al. Fenofibrate suppressed proliferation and migration of human neuroblastoma cells via oxidative stress dependent of TXNIP upregulation[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015,460(4):983-988.

[15] Halliwell B, Whiteman M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean[J]. Br J Pharmacol, 2004,142(2):231-255.

[16] Zielonka J, Kalyanaraman B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth[J]. Free Radic Biol Med, 2010,48(8):983-1001.

[17] 趙玉政，張卓，楊弋.監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化還原代謝狀態(tài)的遺傳編碼熒光探針[J].中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2017，47(5)：508-521.