紫參薯查爾酮合成酶及異構(gòu)酶基因的克隆與表達(dá)分析

趙景梅　黃東益　張青　許云

摘 要 查爾酮合成酶及其異構(gòu)酶是黃酮類化合物合成途徑中的2個(gè)關(guān)鍵酶，為研究其在紫參薯花青素合成途徑中的功能，利用RT-PCR技術(shù)從紫參薯Da56塊莖中克隆到查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）和查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）基因，分別命名為DaCHS和DaCHI。結(jié)果表明：DaCHS基因包含825 bp的完整開放閱讀框（ORF），預(yù)測(cè)編碼274個(gè)氨基酸；DaCHI基因包含663 bp的完整開放閱讀框，預(yù)測(cè)編碼221個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，紫參薯DaCHS與油棕EgCHS親緣關(guān)系最近，氨基酸相似性達(dá)到90%；紫參薯DaCHI與野茶樹CaCHI親緣關(guān)系最近，氨基酸相似性達(dá)到67%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，DaCHS和DaCHI基因均具有組織表達(dá)特異性，其中DaCHS在花中相對(duì)表達(dá)量最高，而DaCHI在塊莖中相對(duì)表達(dá)量最高；在紫參薯塊莖發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分析表明，DaCHS、DaCHI均在薯塊膨大期相對(duì)表達(dá)量最高。本研究通過對(duì)DaCHS和DaCHI基因全長cDNA序列的克隆與分析，為紫參薯花青素合成途徑的遺傳調(diào)控及花青素形成機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 花青素；查爾酮合成酶；查爾酮合成異構(gòu)酶；基因克??；表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S539 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Chalcone synthase （CHS） and Chalcone isomerase （CHI） play an important role in the process of flavonoids synthesis. To investigate the function of the DaCHS and DaCHI gene in anthocyanin biosynthesis pathway of Dioscorea alata. L.， the complete genes of chalcone synthase（CHS） and chalcone isomerase（CHI） were isolated from the turber of D. alata. by reverse transcription-polymerase chain reaction （ RT-PCR） named as DaCHS and DaCHI. Sequencing results showed that the cDNA sequence of DaCHS gene contained an open reading frame （ORF） of 825 bp encoding a protenin of 274 amino acids， DaCHI gene contained an open reading frame （ORF） of 663 bp encoding a protenin of 221 amino acids. Phylogeneticanalyses showed that DaCHS and DaCHI had high identity to CHS and CHI protein of many plants. The highly similarity of DaCHS protenin was EgCHS protenin with 90% amino identity. The highly similarity of DaCHS protenin was CaCHI protenin with 67% amino identity. Quantitative real-time PCR analysis showed that the DaCHS and DaCHI expression had tissue specificity. The relative expression level of flowers were the highest in DaCHS. In DaCHI， the tubers had the hightest relative expression level. That expression analysis in different development periods of D. alata. tuber， DaCHS and DaCHI all had the hightest relative expression in expansion period of tubers.The cloning and analysis of full-length cDNA sequences of DaCHS and DaCHI genes should lay a foundation for the genetic regulation of anthocyanin biosynthesis pathway and the mechanism of anthocyanin formation.

Key words anthocyanin； chalcone synthase； chalcone isomerase； gene cloning； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.014

紫參薯（Dioscorea alata L.）又名紫大薯、腳板薯，屬于薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea），是一年生或多年生草質(zhì)纏繞藤本植物，也是一種常見的塊莖類糧食作物，占世界塊莖類糧食作物產(chǎn)量的6%[1]，與其它塊莖類作物相比，紫參薯在營養(yǎng)上更具優(yōu)勢(shì)，不僅含有淀粉、蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)，還含有花青素、維生素和礦物質(zhì)[2]。紫參薯因其塊莖中含有大量花青素，可降血脂、抗氧化、降血壓，具有很好的藥用價(jià)值[3]，在中國已被作為傳統(tǒng)的保健食品[4]。

查爾酮合成酶及其異構(gòu)酶一同構(gòu)成類黃酮合成途徑的限速酶[5]。CHS是類黃酮生物合成過程中第一個(gè)關(guān)鍵酶，自1983年第1個(gè)序列發(fā)表后[6]，已從多種植物中克隆到了CHS基因。Vander等[7]利用反義RNA技術(shù)抑制矮牽牛CHS基因，導(dǎo)致花青素的合成途徑受阻，矮牽?；ㄉ勺仙兂砂咨?。CHI是黃酮類化合物代謝途徑中的關(guān)鍵酶，含量降低可導(dǎo)致查爾酮大量積累，同時(shí)黃酮類化合物含量減少[8]。Bednar等[9]研究發(fā)現(xiàn)在牽?；ㄖ蠧HI基因表達(dá)量的減少，導(dǎo)致黃酮類化合物減少，從而使花呈現(xiàn)綠色。

查爾酮合成酶催化4-香豆酰-CoA（4-coumaricacyl-CoA）與丙二酰-CoA （malonyl-CoA）縮合形成柚苷配基查爾酮，為黃酮類物質(zhì)提供基本的碳架結(jié)構(gòu)，也為花青素糖苷合成提供保證[10]。查爾酮異構(gòu)酶可催化查爾酮合成柚皮素[11]，即底物先由查爾酮合成酶催化，再通過查爾酮合成異構(gòu)酶異構(gòu)成不同的化合物。目前對(duì)紫參薯的研究主要集中在營養(yǎng)成分分析[12]、栽培[13]、花青素提取工藝[14]、穩(wěn)定性與氧化性[15]及藥理作用的研究[16]等方面，對(duì)紫參薯花青素合成的基因表達(dá)調(diào)控鮮見報(bào)道。本研究通過對(duì)紫參薯DaCHS和DaCHI基因的克隆與生物信息學(xué)分析，并對(duì)DaCHS和DaCHI基因在紫參薯不同組織中及塊莖發(fā)育的不同時(shí)期進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量研究，為紫參薯花青素合成途徑的遺傳調(diào)控及花青素形成機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

紫參薯Da56種植于海南大學(xué)儋州校區(qū)薯蕷種質(zhì)資源圃?？寺≥d體pMD18-T Vector購于Takara公司；大腸桿菌DH5α由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所膠乳代謝課題組提供。TransTaqTE DNA Polymerase High Fidelity （HiFi）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；LA Taq、SYBR@Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）和PrimerScriptTM RT Reagent Kit With gDNAEraser（Perfect Real Time）購自Takara Bio Company；Plasmid Mini Kit I（200 Preps）購自O(shè)mega Bio-Tek公司；PCR引物合成及測(cè)序由南京金斯瑞生物科技公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 紫參薯不同組織和塊莖發(fā)育不同時(shí)期的RNA提取參照北京百泰克通用植物總RNA提取試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄參照Takara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.2.2 紫參薯DaCHS和DaCHI基因的擴(kuò)增 基于紫參薯Da56轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)CHS和CHI基因的上下游引物（表1）。以紫參薯塊莖的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收目的片段與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆送公司測(cè)序。

1.2.3 紫參薯DaCHS 和DaCHI 基因的生物信息學(xué)分析 下載其他植物CHS、CHI基因所編碼的氨基酸序列，使用DNAMAN對(duì)氨基酸進(jìn)行多重序列比對(duì)，使用MEGA6.0構(gòu)建進(jìn)化樹，并分析其同源性。

1.2.4 紫參薯DaCHS 和DaCHI 基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析DaCHS和DaCHI基因在紫參薯不同組織和塊莖發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)情況。根據(jù)所得cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，以毬-Actin作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）說明書，在羅氏LightCycler? 96 system熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后增加溶解曲線。所得數(shù)據(jù)采用2-△△CT的方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量和方差，3次重復(fù)，求平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫參薯總RNA的提取及檢測(cè)

對(duì)提取的紫參薯RNA用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其28S和18S條帶清晰，完整性較好，且OD260/OD280 均在1.8～2.2 之間，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2 紫參薯DaCHS和DaCHI基因的克隆

紫參薯CHS和CHI基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2，紫參薯CHS基因經(jīng)測(cè)序鑒定序列長922 bp，包含825 bp的完整開放閱讀框，42 bp的5非編碼區(qū)（UFR），97 bp的3非編碼區(qū)（UTR），基因命名為DaCHS；紫參薯CHI基因經(jīng)測(cè)序鑒定序列長764 bp，包含663 bp的完整開放閱讀框，31 bp的5非編碼區(qū)（UFR），68 bp的3非編碼區(qū)（UTR），基因命名為DaCHI。經(jīng)分析DaCHS、DaCHI基因具有完整的5和3末端，確認(rèn)是紫參薯查爾酮合成酶和查爾酮異構(gòu)酶基因的全長序列。

2.3 紫參薯DaCHS和DaCHI蛋白的同源性分析

利用NCBI Conserved Domain Search對(duì)DaCHS蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示DaCHS蛋白的第17～274個(gè)氨基酸具有典型的CHS蛋白家族（PLN03172）成員特征，在NCBI下載12種植物CHS基因編碼的氨基酸序列，通過DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)分析（圖3），結(jié)果顯示DaCHS蛋白的氨基酸序列與油棕CHS蛋白相似度高達(dá)90%。

利用NCBI Conserved Domain Search對(duì)DaCHI進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示DaCHI蛋白序列具有CHI蛋白普遍具有的2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域PLN02559和pfam02431。在NCBI下載12種植物CHI基因編碼的氨基酸序列，通過DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)分析（圖4），結(jié)果顯示DaCHI蛋白的氨基酸序列與野茶樹的CHI蛋白相似度較高為67%。

2.4 紫參薯DaCHS和DaCHI蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將紫參薯CHS蛋白與9個(gè)不同物種的CHS同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果見圖5，紫參薯CHS蛋白與油棕（Elaeis guineensis）、木薯（Manihot esculenta）等物種的CHS蛋白聚為一類，而與甜橙（Citrus sinensis）、葡萄（Vitis vinifera）、相思樹（Acacia confusa）等物種的CHS蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

將紫參薯CHI蛋白與11個(gè)不同物種的CHI同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果見圖6，紫參薯CHI蛋白與野茶樹（Camellia sinensis）等物種CHI蛋白聚為一類，而與甘薯（Ipomoea batatas）、芝麻（Sesamum indicum）、橄欖（Canarium album）、龍眼（Dimocarpus longan）等物種CHI蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.5 DaCHS和DaCHI基因在紫參薯不同組織中及塊莖發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，在紫參薯不同組織中，DaCHS在葉、花、皮和根中均有表達(dá)，其中在花中表達(dá)量最高，在塊莖中表達(dá)量最低；DaCHI在所有組織部位均有表達(dá)，其中在塊莖和花中表達(dá)量較高，在莖中表達(dá)量最低（圖7-A、圖8-A）。在紫參薯塊莖發(fā)育不同時(shí)期中，DaCHS和DaCHI均在塊莖膨大期表達(dá)量達(dá)到最高，而在塊莖發(fā)育的其它時(shí)期，DaCHS幾乎不表達(dá)，DaCHI在塊莖發(fā)育形成期具有較高的表達(dá)量（圖7-B、圖8-B）。表明DaCHS和DaCHI基因存在明顯的組織特異性和時(shí)空性。

3 討論

花青素的生物合成是受多基因共同調(diào)控的一個(gè)復(fù)雜過程，不是受單個(gè)基因催化調(diào)控的，在花青素合成過程中，其它基因旳表達(dá)及基因之間的協(xié)同或拮抗作用都可能對(duì)花青素的積累造成重要影響。本研究根據(jù)紫參薯Da56轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用RT-PCR技術(shù)，獲得花青素代謝途徑的上游基因DaCHS和DaCHI。BLAST比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)DaCHS蛋白與葡萄、油棕和木薯的CHS蛋白高度同源，相似性分別為90%、89%和89%，該結(jié)果與Lanz等[17]的研究結(jié)果相符合。DaCHI蛋白與茶樹、蘆筍和玫瑰的CHI蛋白具有較高的同源性，相似性分別為67%、64%和63%，也有研究發(fā)現(xiàn)CHI在結(jié)構(gòu)上變化較大，通常同源性在42%～65%之間，即使在同一物種中不同類型的CHI也會(huì)出現(xiàn)較大差異[18]。

花青素含量在紫參薯不同組織中差異明顯，其含量在植株的生長發(fā)育過程中是逐漸積累的。同時(shí)，CHS和CHI基因在植物不同組織有著不同的表達(dá)模式[19]。Jiang等[20]在白菜研究中發(fā)現(xiàn)BcCHS基因僅在花藥和花瓣中特異表達(dá)，而在莖、葉等部位均不表達(dá)。石曉芳[21]在甘薯研究中發(fā)現(xiàn)8個(gè)甘薯品種的IbCHS基因均僅在葉、薯皮和薯肉中表達(dá)。Zhang等[22]在紫甘薯研究中發(fā)現(xiàn)IbCHI僅在根、莖和葉中表達(dá)。綜上所述，CHS和CHI基因均具有組織表達(dá)特異性，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析DaCHS和DaCHI基因在紫參薯不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示DaCHS在葉、花、皮和根中均有表達(dá)，其中在花中表達(dá)量最高，而DaCHI在所有組織部位均有表達(dá)，其中在塊莖和花中均有較高的表達(dá)量。其表達(dá)量的差異可能是由于紫參薯不同組織部位花青素含量不同導(dǎo)致。

CHS和CHI基因均為多基因家族，在發(fā)育調(diào)控和組織特異性調(diào)控下不同基因有著不同的作用，基因敏感程度的差異容易受到發(fā)育階段和外界環(huán)境刺激的誘導(dǎo)[19， 23]。Lalusin等[24]在研究紫甘薯塊根不同發(fā)育時(shí)期中花色苷關(guān)鍵酶基因的表達(dá)變化中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IbCHS和IbCHI在甘薯中的表達(dá)存在普遍性，均在甘薯發(fā)育早期表達(dá)量最高，中期表達(dá)量降低。在本研究中，DaCHS和DaCHI的表達(dá)量在紫參薯塊莖發(fā)育不同時(shí)期中均出現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象，在塊莖發(fā)育的膨大期表達(dá)量達(dá)到最高，之后迅速下降。其可能是由于花青素的合成需要有足夠的糖作為前體物質(zhì)，在塊莖發(fā)育的萌發(fā)期和形成期是個(gè)可溶性糖迅速積累的過程，在塊莖發(fā)育的膨大期達(dá)到最大，組織中的可溶性糖含量與花青素含量呈正相關(guān)關(guān)系[25]，因此，在塊莖發(fā)育的膨大期可溶性糖含量積累至頂峰，同時(shí)花青素合成達(dá)到最大，從而花青素合成的關(guān)鍵基因DaCHS和DaCHI表達(dá)量也最高。

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