連作茶樹根際土壤自毒潛力、酶活性及微生物群落功能多樣性分析

王海斌 陳曉婷 丁力 邱豐艷 孔祥海 葉江華 賈小麗

摘 要 為了分析茶樹連續(xù)種植后對茶樹根際土壤生理及微生物功能多樣性的影響，本研究以植茶年限4、9、30 a的鐵觀音茶樹根際土壤為材料，探討植茶年限與土壤自毒潛力、土壤酶和土壤微生物功能多樣性關系。結(jié)果表明：隨著植茶年限的增長，茶樹根際土壤對受體萵苣、白菜、蘿卜根長的抑制率呈現(xiàn)顯著性上升。土壤過氧化氫酶、磷酸酶、蛋白酶、蔗糖酶、脲酶活性隨著植茶年限的增長呈下降趨勢，而多酚氧化酶及纖維素酶的活性呈上升趨勢。BIOLOG ECO生態(tài)板法結(jié)果表明，隨著植茶年限的增長，土壤微生物對羧酸類、酚酸類、脂肪酸類及氨基酸和胺類碳源的利用率呈顯著增長，糖類碳源無顯著差異。主成分分析結(jié)果表明，貢獻率為44.29%的主成分1是羧酸類、酚酸類和脂肪酸類物質(zhì)，貢獻率為13.47%的主成分3是含氮物質(zhì)，而貢獻率為42.24%的主成分2是糖類碳源。上述結(jié)果表明，隨著植茶年限的增長，土壤中酸類物質(zhì)不斷積累促使酸化程度加重，與抗氧化和營養(yǎng)循環(huán)相關的土壤酶活性降低，導致土壤養(yǎng)分循環(huán)能力下降，好酸性微生物的數(shù)量增加，土壤微生物種群結(jié)構(gòu)與功能單一化，土壤自毒潛力不斷加劇，不利于茶樹生長。

關鍵詞 茶樹根際土壤；自毒作用；土壤酶活性；微生物功能多樣性

中圖分類號 S571.1 文獻標識碼 A

Abstract To analyze effect of rhizosphere soil environment of tea tree to diversity of functional microbes， soils of 4-， 9- and 30-planted years in Tieguanyin plantation were used as materials， and effects of planting age on soil autotoxicity， enzyme and divercity of functional microbes were explored. The result showed that rhizosphere soil inhibited root length of the lettuce（Lactuca sativa L.）， cabbage（Brassica bara L.） and radish（Raphanus sativus L.） significantly with increased number of planted years. Activities of catalase， phosphatase， protease， sucrose enzyme， urease decreased significantly with increase in planted years， and activities of polyphenol oxidase and cellulose presented an opposite trend. The MDA levels increased significantly with increase of soil planted years. BIOLOG ECO ecological plate method results showed that soil microbes to carboxylic acids， phenolic acids， fatty acids， amino acid and amine carbon source utilization increased significantly with the increase of planting age， and sugar carbon source had no significant difference. Principal component analysis results showed that contribution rates of the principal component 1 （carboxylic acids， phenolic acids and fatty acid）， the principal component 2（sugar carbon source） and the principal component 3（nitrogenous substances） reached 44.29%， 42.24% and 13.47%， respectively. These results showed that accumulation of acid chemicals led to soil acidification aggravating with the increase of planting age， and soil enzyme activity related to antioxidant and nutrient cycling declined， and so soil nutrient cycle suffocated. Furthermore， the number of good acid microbes increased， and soil microbial community structure and function simplified. In final， tea tree growth suffocated due to soil autotoxicity.

Key words rhizosphere soil of tea tree； autotoxicity； activity of soil enzymes； microbial functional diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.004

茶樹是中國重要的經(jīng)濟作物之一，茶樹的生命周期可達百年以上，然而茶樹投產(chǎn)后的經(jīng)濟壽命卻不足20 a[1]。據(jù)國家統(tǒng)計局統(tǒng)計分析，2016年中國茶園面積287萬hm2，茶葉總產(chǎn)量242萬t，居世界首位，然而茶葉單位面積產(chǎn)量卻低于世界平均水平，且有下降趨勢。Zheng等[2]研究表明茶葉連年采收、修剪、肥力供應的不足和茶樹土壤生態(tài)平衡的失調(diào)是導致茶葉產(chǎn)量下降及低產(chǎn)茶園形成的原因。眾多學者嘗試運用不同的方法對低產(chǎn)茶園進行改造，但收效甚微[3-4]。

茶葉品質(zhì)的下降與茶樹連作障礙的形成有關。據(jù)報道，茶樹連作障礙形成的原因主要為：茶樹自身根系分泌物及其互斥反應、土壤營養(yǎng)成分失衡、土壤酸堿度異常、線蟲數(shù)量及土壤病原物的增多[2，5]。眾所周知，植物生長過程中體內(nèi)物質(zhì)對外的釋放途徑，除了揮發(fā)性物質(zhì)，其余均需經(jīng)載體土壤傳播，進而對其他植物產(chǎn)生影響[6-8]。茶樹物質(zhì)的釋放主要通過根系進行，根際的區(qū)域有限，一般指貼近根表或根軸的區(qū)域。根際存在的化學條件和進行的生物化學過程不同于本體土壤。其中最明顯的就是根際pH值、氧化還原電位和微生物活性的變化等，在根際土壤溶液中養(yǎng)分濃度的分布與本體土壤有明顯差異[9-12]。因此，根系與土壤連接的區(qū)域便形成了一種獨特的根際生態(tài)系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中微生物在茶樹物質(zhì)的影響下發(fā)生著顯著變化，如土壤微生物活動、種群分布、多樣性及酶活性等[13-14]。伍麗等[15]探討茶樹根際土壤因子對根際微生物數(shù)量影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶樹主要通過改變土壤pH值、速效磷及其它因子來改變土壤真菌及細菌的數(shù)量；林生等[16-17]探討不同年限茶樹土壤微生物的功能多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著茶樹樹齡的增加，茶樹根際土壤的pH值呈下降趨勢，運用末端限制性片段長度多樣性（T-RFLP）技術分析根際土壤微生物多樣性時發(fā)現(xiàn)，不同年限茶樹根際土壤的微生物種群多樣性存在著顯著的差異。孫海新等[13]研究發(fā)現(xiàn)，茶樹種植土壤的肥力對土壤真菌數(shù)量的變化具有顯著的相關性；茶樹連作對土壤微生物的研究眾多，然而大量學者在于探討茶樹根際微生物群落結(jié)構(gòu)的改善與變化，對于茶樹連作土壤的酶活性及微生物功能性變化的研究較少。因此，本研究以連作4、9、30 a的土壤為材料，以未種植茶樹的土壤為對照，分析連作茶樹土壤的酶活性及微生物功能多樣性的變化，以期為茶園改造、茶樹連作障礙的消減提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以鐵觀音原產(chǎn)地福建省泉州市安溪縣為研究地點，收集已種植4、9、30 a的鐵觀音茶樹根際土壤，以未種植茶樹的土壤為對照，用于土壤自毒潛力評價、土壤酶活性測定及微生物功能多樣性的Biolog分析。取樣地位于東經(jīng)117°93′、北緯24°97′，海拔在650～800 m范圍，年降雨量1 800 mm，相對濕度80%左右，年平均氣溫16～18 ℃。取樣地茶園總面積134 hm2，其中4 a茶樹種植面積約為23 hm2，9 a茶樹種植面積為26 hm2，30 a茶樹種植面積為0.6 hm2。茶樹根際土壤取樣參考Fujii等[18]的5點取樣法。選擇合適的茶樹，去除表層落葉，輕挖茶樹，除去茶樹周邊附著土壤，抖落離茶樹根系1 cm的土壤即為根際土壤。每個樣品收集5株茶樹根際土壤混合，收集樣品量300 g。以茶園內(nèi)未種植茶樹的荒地土壤為空白對照土壤，按照上述取樣法，去除地表植被和凋落物后，收集15～25 cm范圍的土壤，3個重復樣點，收集樣品量300 g。茶園土壤的基本理化指標為，有機質(zhì)含量10.45 g/kg、全氮含量2.63 g/kg、全磷含量1.37 g/kg、全鉀含量1.72 g/kg、速效氮含量27.2 mg/kg、速效磷含量79.3 mg/kg、速效鉀含量305.2 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 土壤對受體的影響 土壤對受體的影響采用土壤-瓊脂三明治法進行測定，并略做修改[19]。稱取土壤15 g樣品，加入冷卻至約45 ℃左右的濃度為0.8%的瓊脂溶液30 mL，充分混勻，待固化后再加2 mL濃度為0.5%的瓊脂溶液復蓋表面，冷卻后每個培養(yǎng)皿中分別播入10粒預萌發(fā)的萵苣、白菜、蘿卜，以空白土壤處理為對照，6次重復，置于人工氣候箱中。萵苣培養(yǎng)溫度為25 ℃，白菜、蘿卜的培養(yǎng)溫度為30 ℃，每天光照12 h（7：00～19：00）。萵苣培養(yǎng)3 d后測定根長，白菜、蘿卜培養(yǎng)5 d后測定其根長。不同土壤對受體的影響采用相對抑制率（Inhibition rate，IR）來評價，計算公式為：IR=（1-處理值/對照值）×100%。

1.2.2 土壤酶活性測定 依據(jù)關松蔭[20]的方法測定土壤酶活性；過氧化氫酶活性的測定采用高錳酸鉀滴定法；多酚氧化酶活性的測定采用鄰苯三酚比色法；脲酶活性的測定采用比色法；蛋白酶活性的測定采用Folin-Ciocslteu法；磷酸酶活性的測定采用對硝基苯磷酸鹽法；蔗糖酶活性的測定采用硝基水楊酸法；纖維素酶活性的測定采用蒽酮比色法。

1.2.3 土壤微生物功能多樣性測定 采用BIOLOG ECO微平板法[21]測定不同土壤的微生物功能多樣性。上樣前將BIOLOG ECO平板預熱到25 ℃，用移液器取150 μL提取液于各孔中，28 ℃避光隔水恒溫培養(yǎng)，在0、1、2、3、4、5、6、7 d用ELISA反應平板讀數(shù)器讀取平板中各反應孔在590 nm處的吸光值。采用BIOLOG ECO平板中每孔顏色平均變化率（average well color development，AWCD）表示土壤微生物群落ELISA反應的結(jié)果。AWCD=[∑（Ci-R）]/N，其中Ci是所測定的31個碳源孔的吸光值，R為對照孔的吸光值，N為碳源的數(shù)目。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)分析過程中的方差顯著性分析及相關性分析、主成分分析均使用DPS軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種植年限茶樹根際土壤對受體的影響

不同年限茶樹土壤對受體的影響結(jié)果見表1，隨著茶樹種植年限的增加，茶樹根際土壤對受體萵苣、白菜、蘿卜的影響加劇，與對照相比，表現(xiàn)為受體根長隨植茶年限的延長而下降，即受體根長抑制率呈上升的趨勢，且不同年限之間存在顯著性差異。

2.2 不同種植年限茶樹根際土壤酶活性分析

土壤酶活性分析結(jié)果見表2，對照土壤的多酚氧化酶、過氧化氫酶、磷酸酶、蛋白酶、蔗糖酶、脲酶、纖維素酶活性分別為0.34、2.61、0.46、2.51、14.38、2.49、1.97 mg/g；與對照土壤相比，隨著土壤年限的增加（4、9、30 a），過氧化氫酶、磷酸酶、蛋白酶、蔗糖酶、脲酶的活性均呈下降趨勢，而多酚氧化酶、纖維素酶活性則呈上升趨勢。

相關性分析結(jié)果見表3，根際土壤對受體萵苣的抑制率與根際土壤的過氧化氫酶活性、磷酸酶活性、蛋白酶活性、蔗糖酶活性、脲酶活性呈顯著或極顯著負相關，而與多酚氧化酶活性、纖維素酶活性呈顯著正相關；除脲酶以外，根際土壤對受體白菜和蘿卜的抑制率與其它酶活性的相關性均未達到顯著水平。

2.3 不同種植年限茶樹根際土壤微生物碳源利用率與主成分分析

以第7天測定的不同土壤微生物對碳源利用率的AWCD值進行分析，結(jié)果見圖1，隨著植茶年限的增加，茶樹根際土壤微生物對羧酸類、酚酸類、脂肪酸類、氨基酸和胺類碳源利用率的AWCD值呈現(xiàn)上升趨勢，而對糖類無顯著差異，且羧酸類碳源的利用率在0、4 a土壤中不存在顯著差異，0、4 a土壤與9、30 a土壤存在顯著差異。可見，不同年限土壤微生物對碳源利用程度存在明顯的區(qū)別。

進一步分析不同年限茶樹土壤微生物對碳源利用率的主成分，結(jié)果見圖2，不同年限土壤微生物對31種碳源的利用率劃分成3大成分，即主成分1、主成分2、主成分3，貢獻率分別為44.29%、42.24%、13.47%。此外，由圖2可看出，3大主成分分別將4種不同樣品劃分在不同的區(qū)域，可見，31種碳源劃分的3大成分能夠有效區(qū)分4種不同的樣品。

2.4 不同碳源與主成分的相關性分析

由表4可見，與主成分1相關的碳源有9種，分別是酚酸類（2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸）、羧酸類（吐溫40、吐溫80、丙酮酸甲酯）和脂肪酸類（D-蘋果酸、α-丁酮酸、γ-羥基丁酸、甲叉丁二酸）；與主成分2相關的碳源主要是6種糖類；與主成分3相關的碳源有3種，主要是含氮的氨基酸（L-天冬酰胺）和胺類（苯乙胺、腐胺）?？梢姡?大主成分有效區(qū)分4種不同的土壤樣品，而在區(qū)分4種不同土壤樣品的過程中，主成分1中起主要貢獻作用的是酚酸類、羧酸類、脂肪酸類碳源，主成分2中起主要貢獻作用的是糖類碳源，主成分3起主要貢獻作用的是含氮的氨基酸和胺類碳源。

3 討論

植物在生長及衰退過程中都會向土壤釋放大量的次生代謝物，同一植物在連續(xù)種植后，其向土壤環(huán)境釋放的次生代謝物不斷積累，當達到某一濃度時即可與同類植物產(chǎn)生互作毒害作用[5]。本研究以不同年限茶樹根際土壤為材料進行生物測試，結(jié)果表明茶樹根際土壤對受體萵苣、白菜、蘿卜根長的抑制作用隨著植茶年限的增加而增大。Wu等[22]研究發(fā)現(xiàn)地黃連作后，連作土壤對受體的影響隨著土壤連作年限的增加而增大。陳冬梅等[23]研究煙草連作后，土壤的化感自毒潛力也同樣得到類似的結(jié)果?？梢姡S著茶樹植茶年限的增加，茶樹根際土壤的自毒潛力呈上升趨勢。

本研究進一步探討茶樹根際土壤酶活性的變化，結(jié)果表明，大部分土壤酶活性隨著植茶年限的延長呈下降趨勢，而多酚氧化酶及纖維素酶活性呈上升趨勢。過氧化氫酶主要與土壤抗氧化性相關[24]，可見植茶年限的延長使得土壤的抗氧化能力下降。營養(yǎng)元素是茶樹生長的基礎，土壤中的磷酸酶、蛋白酶、蔗糖酶、脲酶活性與土壤中的P、N、C等的循環(huán)呈正相關[25]。植茶年限的延長使得磷酸酶、蛋白酶、蔗糖酶、尿酶活性呈下降趨勢，造成土壤中養(yǎng)分的循環(huán)能力下降，土壤營養(yǎng)元素缺乏，導致茶樹生長受阻。多酚氧化酶與土壤抗性及土壤內(nèi)部酚類物質(zhì)的氧化有關，而纖維素酶與纖維素的降解有關[26]。植茶年限的延長，土壤中殘留的茶樹枯枝落葉較多，而茶樹葉片本身含有大量的多酚聚合體和生物堿，在纖維素酶作用下會降解釋放出酚酸類物質(zhì)，為多酚氧化酶的活性增強提供了基礎材料，而酚類物質(zhì)氧化后可能轉(zhuǎn)變?yōu)樽远灸芰^強的物質(zhì)醌、酚酸或其他物質(zhì)還有待于研究。相關性分析也表明了根際土壤對受體的抑制率與土壤酶活性有關聯(lián)。

土壤微生物對碳源的利用率和主成分物質(zhì)分析結(jié)果表明，貢獻率為42.24%的主成分2主要是糖類物質(zhì)，在3個年份的樣品間沒有差異。而貢獻率為44.29%的主成分1和13.47%的主成分3，主要是酸類物質(zhì)和含氮類物質(zhì)，在3個年份的樣品間隨植茶年限增長而利用率增大，表明隨著植茶年限的增長，茶園土壤中酸類物質(zhì)不斷積累，造成土壤日趨酸化，不利于茶樹生長。楊宇虹等[19]研究發(fā)現(xiàn)連作煙草根系土壤微生物功能發(fā)生變化，連作煙草年限的增加使得土壤的酸類物質(zhì)含量增加。林生等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)，隨著茶樹連作年限的增加，茶樹根際土壤的酸化程度加重，土壤微生物功能多樣性發(fā)生變化，主要變化趨勢是好酸性微生物的數(shù)量增加。茶園屬于單一性植物人工生態(tài)系統(tǒng)，茶樹連續(xù)種植模式改變了土壤原有的生態(tài)平衡系統(tǒng)，使土壤中酸類物質(zhì)不斷積累，好酸性微生物的大量繁殖，土壤微生物種群結(jié)構(gòu)與功能單一化，土壤自毒潛力不斷加劇，不利于茶樹生長。土壤自毒作用的消減方法有植物殘株清理、土壤改良、有益微生物引入及自毒物質(zhì)清除等報道[11-12]，進一步探明“物質(zhì)-微生物-自毒作用”之間的互作機制，將為茶園土壤改良方式提供科學依據(jù)。

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