胡椒堿的提取分離及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

張曉旭　周錫欽　劉紅芹　徐寶財(cái)

摘 要 胡椒堿是胡椒中的主要活性成分之一，具有抗炎、抑菌、抗氧化等活性，更有潛力被開(kāi)發(fā)為新的抗癌藥物。本文重點(diǎn)介紹胡椒堿的提取分離方法以及檢測(cè)方法，以期為相關(guān)的科學(xué)研究提供參考。

關(guān)鍵詞 胡椒堿；提取分離；檢測(cè)；進(jìn)展

中圖分類號(hào) Q949.732.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Piperine， which is one of the main active ingredients of pepper， has many biological activities， such as the anti-inflammatory， antibacterial， anti-oxidation and so on. It also has the potential to be developed as a new anticancer drug. In this paper， the extraction， separation and determination methods of piperine are introduced as the focal points， with a view to provide references for relevant scientific research.

Key words piperine； extraction and separation； determination； progress

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.030

胡椒（Piper nigrum Linn.）又名白川、浮椒及王椒，是胡椒科、胡椒屬常綠熱帶藤本植物，原產(chǎn)于印度，1947年引入中國(guó)，在海南省、云南省西部、廣東省湛江地區(qū)、廣西南部和福建省云宵縣部分地區(qū)等都有種植，其中海南省是主產(chǎn)區(qū)。目前胡椒的種植面積超過(guò)3×104 hm2，占世界總面積排名第6位，年總產(chǎn)量超過(guò)3×107 kg，世界排名第5位。胡椒的未成熟果實(shí)干后，去皮皺縮為黑，稱之為黑胡椒，成熟果脫皮而白，稱之為白胡椒。胡椒中的活性成分主要是酰胺類化合物，其中尤以胡椒堿活性最強(qiáng)、含量也最多。胡椒堿不僅可以作為香料和調(diào)味料，還具有非常重要的藥用價(jià)值，如抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗驚厥、抗抑郁、健胃、抑菌、降血糖和肝保護(hù)作用等[1-6]。另外，胡椒堿對(duì)羥基有較好的清除作用，還可作為抗氧化劑[7]。同時(shí)胡椒堿也被證明可以提高四環(huán)素、鏈霉素、異煙肼和乙胺丁醇等藥物的生物利用度[8]。已有研究表明，胡椒經(jīng)加工后可得到胡椒堿，其附加值可提高10倍[9]。由于胡椒堿的功能作用，無(wú)論是食品工業(yè)還是醫(yī)藥工業(yè)中都需要更高純度的胡椒堿，因此，開(kāi)發(fā)出純度更高、質(zhì)量好、產(chǎn)率高、成本低的天然胡椒堿產(chǎn)品進(jìn)入世界市場(chǎng)，將有利于發(fā)展中國(guó)的胡椒產(chǎn)業(yè)，對(duì)提高農(nóng)產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和綜合利用率等都有著重要的意義。

目前胡椒堿的提取方法主要有有機(jī)溶劑提取法和酸水解法等，胡椒堿的含量測(cè)定方法主要有高效液相色譜法、紫外分光光度法和薄層色譜法等。本綜述主要分析、總結(jié)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外提取分離和測(cè)定胡椒堿的一些研究報(bào)道，以期為相關(guān)方面的科學(xué)研究提供參考。

1 胡椒堿的提取分離

1.1 超臨界流體萃?。⊿upercritical fluid extraction，SFE）

SFE特別適合富含生物活性的天然物質(zhì)的提取分離，它是以超臨界流體作為萃取媒介，利用超臨界流體的溶劑化效應(yīng)溶解待分離的液體或固體混合物，然后通過(guò)減壓或調(diào)解溫度來(lái)降低其密度，從而降低其溶劑能力，使萃取物得到分離。SFE因具有分離工藝簡(jiǎn)單、萃取效率高等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用到食品、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域等，其中以CO2 為溶劑的SFE技術(shù)因其對(duì)有機(jī)物溶解能力強(qiáng)、選擇性好，且CO2無(wú)毒、惰性、易得，已成為SFE技術(shù)中最為重要的研究和應(yīng)用技術(shù)。

Andrade等[10]采用超臨界CO2法提取胡椒中的胡椒堿，研究表明最佳提取工藝條件為：提取溫度為40 ℃，壓力為200 bar，無(wú)水乙醇添加量為7.5 %（V：V），CO2恒定溶劑流速為（8±2） g/min。Dutta等[11]利用超臨界CO2法提取胡椒中的胡椒堿，從20 g平均粒徑為0.42 mm的胡椒粉中提取胡椒堿的最佳條件為：提取溫度為60 ℃，壓力為300 bar，提取時(shí)間為45 min，CO2流量為2 L/min。Grinevicius等[12]采用超臨界CO2法從黑胡椒中提取抗腫瘤活性物質(zhì)，研究表明，其主要成分為胡椒堿和萜類化合物，當(dāng)提取溫度為40 ℃，壓力為200 bar，CO2流量為（8±2） g/min時(shí)，提取物的抗腫瘤活性最高，此時(shí)提取物中胡椒堿的含量也最高（6.035±0.014）%。

1.2 酶輔助超臨界二氧化碳提取

酶輔助超臨界二氧化碳提取技術(shù)是一種比較新興的試驗(yàn)手段，可以更加有效地提高胡椒堿的提取產(chǎn)率。Dutta等[11]利用此方法提取黑胡椒中的胡椒堿，所用酶為α-淀粉酶（來(lái)自地衣芽孢桿菌），研究對(duì)比了酶添加前后胡椒堿提取物產(chǎn)率的變化，并在分批和連續(xù)模式下進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。研究表明最佳酶配比為：酶量：黑胡椒粉=1：5 000，時(shí)間為2.25 h，CO2流量為2 L/min。在連續(xù)模式下，酶的比活性提高了2.13倍，批量模式呈現(xiàn)1.25倍增加，同時(shí)胡椒堿提取物的產(chǎn)率均有明顯增長(zhǎng)。

1.3 酶法提取

酶法提取中草藥活性物質(zhì)是提取工藝的一大發(fā)展，近年來(lái)酶技術(shù)在植物有效成分提取方面的研究已有不少，其中纖維素酶的應(yīng)用最為廣泛，效果也較為顯著。植物細(xì)胞壁的主要成分為纖維素和果膠，添加纖維素酶能有效地破壞細(xì)胞壁，從而有利于細(xì)胞中的活性成分的溶出。利用超聲輔助酶法可進(jìn)一步強(qiáng)化纖維素的酶解作用，提高目標(biāo)物質(zhì)的提取率。劉笑[13]利用纖維素酶提取白胡椒中的胡椒堿，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行條件優(yōu)化，確定3.0 g白胡椒粉中提取胡椒堿的最佳工藝為：纖維素酶為6 mg，酶解溫度為50 ℃，酶解液pH值為7，時(shí)間為6 h，此條件下提取物中胡椒堿的含量可達(dá)5.29 %。

1.4 有機(jī)溶劑法

胡椒堿幾乎不溶于水，微溶于乙酸，可溶于苯或醋酸，易溶于氯仿和乙醇，因此可用有機(jī)溶劑法萃取。徐士明等[14]利用85%的乙醇提取胡椒中的胡椒堿，確定最佳工藝條件為：回流提取2次，乙醇（體積）：胡椒（質(zhì)量）為10：1，濾液合并，濃縮，動(dòng)態(tài)冷卻結(jié)晶，無(wú)水乙醇多次結(jié)晶，提取的胡椒堿純度大于98 %。Subramanian等[15]用甲醇作為萃取溶劑，利用索氏抽提技術(shù)提取胡椒中的胡椒堿，測(cè)得粗胡椒堿的含量為3.80%。

1.5 超聲波輔助有機(jī)溶劑萃取法

超聲波輔助有機(jī)溶劑萃取法是一種現(xiàn)代的分離方法。超聲波的空化作用會(huì)產(chǎn)生極大壓力，提高細(xì)胞壁的通透性，有助于細(xì)胞中有效成分的迅速釋放。同時(shí)超聲的振動(dòng)效應(yīng)和熱效應(yīng)可增加傳質(zhì)系數(shù)，增大溶質(zhì)的接觸面積，進(jìn)而增加溶質(zhì)的溶解度。該法具有時(shí)間短、效率高和常溫即可進(jìn)行的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于天然物料的提取分離[16]。Rathod等 [17]采用超聲輔助有機(jī)溶劑法從胡椒中提取胡椒堿，用乙醇作為提取溶劑，提取時(shí)間18 min，料液比為1：10，超聲功率為125 W，超聲頻率為25 kHz，溫度為50 ℃。研究表明胡椒堿的提取效率比傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法要高。陳盛余等[18]采用超聲波輔助有機(jī)溶劑萃取法從胡椒中提取胡椒堿，最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%，提取時(shí)間為45 min，提取溫度為70 ℃，料液比1：30（g：mL）。此條件下，提取物中胡椒堿的含量可達(dá)6.12 %。

1.6 加壓液體萃取法（Pressurized liquid extraction，PLE）

加壓液體萃取法（PLE）是由連續(xù)溶劑流過(guò)固定的含有固體顆粒的萃取柱進(jìn)行萃取，其特點(diǎn)是需要溶劑較少且具有較高的提取效率，同時(shí)還可減少萃取時(shí)間[19-20]。Andrade等[10]用乙醇作為PLE溶劑，將20 g研磨的黑胡椒粉裝入提取容器中，壓力設(shè)置為100 bar，溫度為40 ℃，乙醇流速保持在3 mL/min，提取時(shí)間為60 min。

1.7 離子液體的超聲波輔助提取法（Ionic liquid-based ultrasonic-assisted extraction，ILUAE）

Cao等[21]采用基于系列1-烷基-3-甲基咪唑離子液體的超聲波輔助提取法（ILUAE）從白胡椒中提取胡椒堿，評(píng)價(jià)了烷基鏈長(zhǎng)度和陰離子種類對(duì)胡椒堿的提取效率的影響，結(jié)果表明其對(duì)胡椒堿的萃取效率都有顯著的影響。

1.8 微波輔助有機(jī)溶劑提取法

微波輔助有機(jī)溶劑提取法的原理是以溶液內(nèi)的離子和分子接受微波輻射獲得能量而升溫為基礎(chǔ)，從而提高溶質(zhì)進(jìn)入溶劑的能力，此方法的優(yōu)點(diǎn)是耗能低、時(shí)間短、效率高并可節(jié)省萃取劑的使用

量[22]。王友志等[23]采用微波輔助有機(jī)溶劑法提取胡椒中的胡椒堿，確定最佳提取工藝為：乙醇濃度為80 %，微波功率為500 W，提取時(shí)間為60 min，提取溫度為55 ℃，料液比80：50，此條件下提取物中胡椒堿的含量可達(dá)4.12 %。

1.9 超聲波—微波協(xié)同萃取法

超聲波—微波協(xié)同萃取儀中設(shè)有冷凝裝置，可以極大提高胡椒堿中胡椒油樹脂的得率，減少其揮發(fā)性成分的損失。吳桂蘋等[24]以黑胡椒為主要原料，研究熱回流提取、索氏抽提和超聲波—微波輔助等提取方法對(duì)胡椒油樹脂得率的影響，并用HPLC分析測(cè)定胡椒堿的含量。結(jié)果表明，不同提取方法所得胡椒油樹脂及胡椒堿含量有顯著性差異，其中超聲波—微波協(xié)同萃取法得到的胡椒油樹脂的得率最高。

1.10 酸水解法

胡椒堿在水中基本不溶，可以在水中加入酸使得胡椒堿轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的胡椒堿鹽溶解于水中，從而被提取出來(lái)。Aziz等[25]采用醋酸作為提取溶液從黑胡椒中提取胡椒堿，15 g黑胡椒使用500 g溶劑，提取物中胡椒堿的含量可達(dá)3.0 %。

比較、分析胡椒堿的提取效果及工藝參數(shù)，總結(jié)出了各種提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)（表1）。

2 胡椒堿的檢測(cè)方法

有關(guān)胡椒堿純度的測(cè)定，人們已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究。目前最常用的方法有高效液相色譜法（HPLC）、紫外分光光度法和薄層色譜法等。

2.1 高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）

HPLC法作為一種新型的分離分析技術(shù)，簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，是當(dāng)今使用最為廣泛的技術(shù)方法。王新靈等[26]利用HPLC法檢測(cè)胡椒中的胡椒堿，色譜柱為Diamonsil C18柱，流動(dòng)相為甲醇，流速為0.25 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為0.2 μL。楊秋霞等[27]采用HPLC法測(cè)定八味肉桂膠囊4種成分的含量，所用色譜柱為5C18-MS-II柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），乙腈—1%的乙酸梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為35 ℃。研究結(jié)果表明胡椒堿的平均回收率為100.46 %，RSD為2.41%（n=6）。

2.2 反相高效液相色譜法（Reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）

RP-HPLC法具有操作簡(jiǎn)便、可靠性高、準(zhǔn)確性高和重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)。葉靜等[28]建立了一種測(cè)定紅花如意膠囊中胡椒堿含量的 RP-HPLC法。他們采用Kromasil C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），以甲醇—水（64：36，V：V）為流動(dòng)相，流速為 1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為343 nm，柱溫為30 ℃。研究表明胡椒堿含量在0. 0416～0. 228 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r2 =0.999 8），平均回收率為98.82%（n = 6），RSD為1.1%。黃毅等[29]利用RP-HPLC法測(cè)定牙膏中胡椒堿的含量，色譜柱是Kromat Universil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇—水（70：30，V：V），檢測(cè)波長(zhǎng)為343 nm，流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，研究表明胡椒堿在0.5 ～15 μg/mL范圍呈良好的線性關(guān)系（r2=0.999 9），胡椒堿的平均回收率在92.09%～118.20%之間。Shah等[30]采用RP-HPLC法檢測(cè)胡椒堿的含量，他們采用C18柱，流動(dòng)相為二氫正磷酸氫鉀（pH=6.5）—乙腈（30：70，V：V），流速為1 mL/ min。

2.3 反相高效液相色譜—二級(jí)管陣列法（Reversed phase high performance liquid chromatography diode array detector，RP-HPLC-DAD）

Lu等[31]采用RP-HPLC-DAD方法檢測(cè)黑胡椒中的胡椒堿含量，所用色譜條件：Zorbax-SB C18柱（4.6 × 150 mm，3.5 μm；Agilent，Santa Clare，USA）；流動(dòng)相A為0.1%磷酸水溶液，流動(dòng)相B為100 %乙腈；梯度洗脫：0 ～25 min，2%～ 25% B，25～32 min，25%～ 40% B，32～40 min，40%～50% B，40～50 min，50%～70% B；流速為0.75 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為25 μL。

2.4 紫外分光光度法

紫外分光光度法是一種測(cè)定胡椒堿含量的通用方法，具有操作簡(jiǎn)單、方便快捷的特點(diǎn)。Grinevicius等[12]采用紫外分光光度法確定了胡椒提取物中胡椒堿的存在。楊敏等[32]利用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定蓽茇藥材中的胡椒堿含量，溶劑為無(wú)水乙醇，檢測(cè)波長(zhǎng)為343 nm，研究表明胡椒堿在0.398～7.952 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r2=0.9995，n=6），RSD=1.10%。此方法檢測(cè)速度快、方便，但也存在準(zhǔn)確度不高、靈敏度較低和干擾物質(zhì)多等一些問(wèn)題。

2.5 薄層色譜法（Thin layer chromatography，TLC）

薄層色譜法是近幾年發(fā)展的快速分離和定性分析微量物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，屬于固—液吸附色譜。此方法簡(jiǎn)便易行、靈敏、準(zhǔn)確，還具有樣品用量少、有機(jī)溶劑消耗少、檢測(cè)迅速和無(wú)固定相污染等優(yōu)勢(shì)。Rajopadhye等[33]研究了胡椒屬植物中胡椒堿的薄層色譜定量法，在GF254硅膠板上，用甲苯—乙酸乙酯—乙醚（6：3：1，V：V：V）展開(kāi)體系將胡椒堿進(jìn)行了有效的分離。分離后的試樣在波長(zhǎng)337 nm下掃描定量，胡椒堿的線性范圍為15～75 ng，加標(biāo)回收率為94.53%。Samten等[34]建立了一種簡(jiǎn)便廉價(jià)的TLC圖像分析方法，用于定量不丹傳統(tǒng)藥用制劑中胡椒堿的含量。他們使用數(shù)碼相機(jī)拍攝254 nm波長(zhǎng)紫外光下的TLC色譜圖像，并利用Scion Image軟件進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)化成密度剖面圖，通過(guò)將其峰面積與在相同TLC板上的胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品建立的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來(lái)計(jì)算胡椒堿的濃度。校正數(shù)據(jù)的線性回歸分析顯示響應(yīng)與胡椒堿含量之間呈線性關(guān)系（r2= 0.996 2）。該方法的特異性、精度、準(zhǔn)確度和恢復(fù)率都令人滿意，缺點(diǎn)是其靈敏度稍低，檢測(cè)限為15.36 ng。

2.6 高效薄層色譜法（High Performance thin-layer chromatography，HPTLC）

HPTLC是TLC的增強(qiáng)形式，與HPLC和GC同屬痕量分析方法，可提高薄層色譜的分辨率，具有分離度好、準(zhǔn)確性高、低成本和高效率等特點(diǎn)。Alam等[35]利用HPTLC定量分析黑胡椒中的胡椒堿，流動(dòng)相是甲苯—乙酸乙酯—冰乙酸（7：3：0.5，V：V：V），薄層色譜板是玻璃背面的硅膠60F-254板，掃描波長(zhǎng)為280 nm。

2.7 氣質(zhì)聯(lián)用法（Gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）

Hussain等[36]利用GC-MS測(cè)定黑胡椒中的胡椒堿含量。使用的柱子是RTx?-1（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm）；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持60 s，然后以10 ℃/min速率升溫至180 ℃并保持1 min，繼續(xù)以20 ℃/min速率升溫至280 ℃，保持15 min；載氣為氦氣（99.99%）；電子電離（EI）電壓為70 eV。

2.8 氣質(zhì)聯(lián)用薄層色譜法

Delia[37]采用GC-MS聯(lián)用薄層色譜法鑒定黑胡椒中的胡椒堿，先采用薄層色譜法對(duì)胡椒堿進(jìn)行鑒定，使用的薄層板是Polygram Sil G/UV 254 Macherey Nagel，流動(dòng)相為甲苯—乙酸乙酯（70：30，V：V），UV檢查器（254，366 nm）。之后采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)胡椒堿的含量進(jìn)行定量，氣相色譜柱是MP-MS柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），載氣為氦氣，溫度程序：初始溫度60 ℃，然后以3 ℃/min的速率升溫至250 ℃。研究結(jié)果表明該方法具有檢測(cè)迅速、簡(jiǎn)便易行、靈敏且樣品用量少和有機(jī)溶劑消耗少的優(yōu)點(diǎn)。

2.9 高效毛細(xì)管電泳法（High performance capillary electrophoresis，HPCE）

HPCE是依據(jù)樣品各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法，具有電泳和色譜技術(shù)的雙重優(yōu)點(diǎn)。李和光等[38]利用HPCE鑒定白胡椒中的胡椒堿。電泳條件：石英毛細(xì)管柱（50 μm × 90 cm），緩沖液為Na2HPO4和NaH2PO4，分離電壓為28 kV，溫度為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為343 nm。研究結(jié)果表明胡椒堿在0.05～0.30 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r2= 0.999 5）。但該方法存在一些弊端，如電滲會(huì)因樣品組成而變化，進(jìn)而影響分離重現(xiàn)性。

2.10 核磁共振法

核磁共振技術(shù)被廣泛用于分子結(jié)構(gòu)的測(cè)定，并且還可用于定量分析，其原理是核磁共振信號(hào)的積分強(qiáng)度直接與該信號(hào)所代表的原子核數(shù)呈正比。趙丹[39]利用核磁共振一維和二維技術(shù)對(duì)胡椒堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，并利用核磁共振氫譜定量分析胡椒堿的含量，經(jīng)過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，證明此方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高且重現(xiàn)性好。

2.11 高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）

LC-MS/MS技術(shù)是把具有高分離能力的液相色譜和可以提供結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜結(jié)合起來(lái)，具有高靈敏度、選擇性的優(yōu)勢(shì)，尤其是串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用，可以得到豐富有效的化合物結(jié)構(gòu)信息，從而建立快速、高效的分析研究體系。吳惠勤等[40]利用LC-MS/MS法測(cè)定地溝油中難揮發(fā)性微量雜質(zhì)成分之一的胡椒堿。樣品經(jīng)過(guò)提取分離后，在電噴霧正離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式采集數(shù)據(jù)并進(jìn)行定性和定量測(cè)定。實(shí)際樣品測(cè)試表明，該方法簡(jiǎn)便快速、靈敏可靠，可作為地溝油鑒別的重要手段之一。Chithra等[41]從胡椒中分離出內(nèi)生真菌，然后利用HPLC法和LC-MS/MS法確定了內(nèi)生真菌分離物中胡椒堿的存在。Chen等[42]利用UPLC-MS/MS法測(cè)定血漿中的胡椒堿含量。樣品通過(guò)液—液萃取（LLE進(jìn)行預(yù)處理，0.2 %的甲酸—乙腈（50：50，V：V）等度洗脫，時(shí)間控制在5 min內(nèi)，色譜柱是C18柱，正離子掃描，選擇性反應(yīng)檢測(cè)，電噴霧電離，維拉帕米用作內(nèi)標(biāo)（IS）。當(dāng)胡椒堿濃度為1～1000 ng/mL時(shí)，此方法具有良好的線性關(guān)系（r2=0.999），且具有良好的回收率、精密度和穩(wěn)定性，檢測(cè)限為1 ng/mL。

2.12 極譜法

胡椒堿化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)C=C鍵，在酸性條件下可在滴汞電極上發(fā)生還原反應(yīng)，產(chǎn)生良好的一階導(dǎo)數(shù)差示脈沖極譜峰。韓文彬等[43]據(jù)此建立了胡椒堿的一階導(dǎo)數(shù)差示脈沖極譜定量測(cè)定法（FD-DPP），實(shí)驗(yàn)表明，胡椒堿的FDDPP峰電位為-0.86 V（pH=4.60），可作為胡椒堿的定性參考。此法操作簡(jiǎn)便、快速、選擇性較好。

2.13 電噴霧電離質(zhì)譜法（Electrospray ionization mass dpectrometr，ESI-IT-MS）

ESI-IT-MS作為一種較新的分析手段，越來(lái)越廣泛地被人們所利用。該方法檢測(cè)快速，可有效與各種色譜聯(lián)用，用于復(fù)雜體系分析，并且可同時(shí)提供精確的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息。Grinevicius等[12]采用ESI-IT-MS法確定了胡椒提取物中胡椒堿的存在。該方法的缺點(diǎn)是每一個(gè)電噴霧的變量如真空度、電勢(shì)、溶劑的揮發(fā)性、溶液的導(dǎo)電性、電解質(zhì)的濃度和樣品液的各種物理特性等都有一個(gè)應(yīng)用的限制范圍，另外，實(shí)驗(yàn)參數(shù)或技術(shù)條件必須根據(jù)需要解決的問(wèn)題去仔細(xì)選擇。

2.14 膠束電動(dòng)色譜法（Micellar electrokinetic chromatography，MEKC）

MEKC是一種非常有效的分離分析方法，被分離組分在流動(dòng)相和由膠束構(gòu)成的固定相之間分配，由于其在兩相之間的保留能力不同而實(shí)現(xiàn)分離。Carolina等[44]采用MEKC分離鑒定花蜜中的生物堿—胡椒堿。Capel?105M毛細(xì)管電泳儀；熔融石英毛細(xì)管長(zhǎng)57 cm（有效長(zhǎng)度50 cm）；毛細(xì)管處理程序：依次用蒸餾水、0.1 mol/L NaOH溶液、蒸餾水各清洗5 min，最后用緩沖液（20 mmol/L硼酸鈉，100 mmol/L SDS，pH 9.30）沖洗3 min；分離電壓為20 kV；毛細(xì)管溫度為25 ℃；樣品以30 bar壓力進(jìn)樣3 s；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；2次進(jìn)樣之間依次用用蒸餾水清洗3 min、0.10 mol/L的NaOH溶液清洗2 min、蒸餾水清洗2 min。

2.15 高效液相色譜分離與電噴霧電離三重串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（High performance liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry ，HPLC-ESI-MS/MS）

Liu等[45]建立了一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏和準(zhǔn)確的HPLC-ESI-MS/MS方法，可以同時(shí)鑒定分析蓽茇中的5種特征組分：胡椒堿、蓽茇明寧堿、Δα，β-二氫蓽茇明寧堿、墻草堿和胡椒新堿。采用的色譜條件：Phenomenex Gemini C18反相柱（50 mm×2.00 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為水（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈（含0.1%甲酸）；流動(dòng)相梯度洗脫：0～0.50 min，2% B，0.50～3.10 min，2%～98% B，3.10～4.00 min，98% B，4.00～4.01 min，2%～98% B，4.01～5.50 min，2% B；流速：0.55 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。質(zhì)譜條件：采用 ESI電離源，正離子掃描，MRM檢測(cè)模式。研究表明該方法顯示出良好的特異性、線性（r2>0.995）、穩(wěn)定性（RSD<2.53%）、重復(fù)性（RSD<2.58%）和回收率（90.0%～103.5 %）。Liu等[46]采用UFLC-ESI-MS/MS方法分析大鼠血漿中的胡椒堿，利用乙腈和乙酸進(jìn)行梯度洗脫，研究表明該方法顯示良好的靈敏度和較低的檢出限（1.0 ng/mL），但該方法存在的主要問(wèn)題是回收范圍（86.6%～120%）較低。

經(jīng)分析、對(duì)比總結(jié)出了檢測(cè)胡椒堿的各種方法的利弊（表2）。

3 展望

胡椒堿作為胡椒中主要的活性化學(xué)物質(zhì)，具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用。目前，胡椒堿的提取分離和分析方法也有較為成熟系統(tǒng)的方法，比較各種提取分離和分析胡椒堿的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每種方法都各有其利與弊。

有機(jī)溶劑輔助微波、超聲、加壓等技術(shù)可提高胡椒堿的提取率，但仍存在有機(jī)溶劑殘留的問(wèn)題。水酶法以及酸水解法提取率較低并且工藝時(shí)間較長(zhǎng)，且酶的活性易受多種因素影響，高濃度的酸對(duì)設(shè)備的腐蝕性比較嚴(yán)重，會(huì)造成環(huán)境污染。離子液體作為一種綠色溶劑，操作簡(jiǎn)單快速，但離子液體與目標(biāo)物質(zhì)難以分離限制了其發(fā)展，對(duì)離子液體的應(yīng)用目前只停留在食品功能分子的提取與分析階段，尚未在食品工業(yè)中大規(guī)模應(yīng)用。超臨界流體萃取分離工藝簡(jiǎn)單、萃取效率高，但生產(chǎn)成本較為昂貴。綜合比較各種提取方法，超臨界流體萃取技術(shù)作為一項(xiàng)具有特殊分離能力的新型技術(shù)，在中國(guó)已逐步走向工業(yè)化，有多種產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)，具有較好的應(yīng)用前景。

比較胡椒堿含量的測(cè)定方法可看出，高效液相色譜法、反相高效液相色譜、反相高效液相色譜—二級(jí)管陣列法、氣質(zhì)聯(lián)用薄層色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜分離與電噴霧電離三重串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法和核磁共振法，準(zhǔn)確度高，此外液質(zhì)與氣質(zhì)還能對(duì)胡椒堿進(jìn)行初步的定性，但檢測(cè)儀器價(jià)格昂貴，在檢測(cè)前需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，方法相對(duì)較為繁瑣，適用于科研單位對(duì)胡椒堿的深入研究。電噴霧電離質(zhì)譜法、高效毛細(xì)管電泳法和膠束電動(dòng)色譜法，對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的提取率受樣品的組成、樣品液的物理特性的影響大，樣品前處理過(guò)程較為繁瑣。極譜法有一定毒性，應(yīng)用受到一定限制。紫外分光光度法、薄層色譜法和高效薄層色譜法檢測(cè)速度快、方便、成本相對(duì)較低，但準(zhǔn)確度不高，且薄層色譜法多數(shù)用于胡椒堿的定性，適用于企業(yè)中對(duì)胡椒品質(zhì)的快速檢測(cè)與分級(jí)。所以對(duì)于胡椒堿的檢測(cè)方法還有待進(jìn)一步的研究和完善，需充分利用現(xiàn)有的高科技手段，研究新的分析方法，從而可以更加簡(jiǎn)單、快速、精確地對(duì)胡椒堿進(jìn)行定量分析。

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