抑制尖孢鐮刀菌人工肽適體的篩選和鑒定

黃君君　馬香　唐鴻倩　劉柱　唐燕瓊

摘 要 香蕉枯萎病嚴(yán)重危害香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究從肽適體文庫中篩選獲得對香蕉枯萎病致病菌尖孢鐮刀菌有抑制作用的人工肽適體SNP-D4。通過構(gòu)建人工肽適體體外重組表達(dá)載體，獲得SNP-D4體外重組蛋白。結(jié)果表明，通過抑菌活性檢測表達(dá)人工肽適體SNP-D4的大腸桿菌全蛋白提取液，能夠特異性抑制尖孢鐮刀菌孢子的萌發(fā)，使其萌發(fā)率降低至19.60%。本研究篩選得到的人工肽適體SNP-D4可應(yīng)用于研發(fā)環(huán)境友好型特異抗真菌生物制劑，為香蕉枯萎病防治提供新的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞 香蕉枯萎??；肽適體；尖孢鐮刀菌；載體構(gòu)建；抑菌活性

中圖分類號 S46 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Banana fusarium wilt was a serious disease which causes great damages to banana-developing industries. Fusarium oxysporum f. sp. cubense FOC4 was considered as the essential pathogen. In this study， the artificial pepaptamer SNP-D4 was identified from our created pepaptamers library for the inhibition of Fusarium oxysporum f. sp. cubense FOC4. The recombinant expression vector SNP-D4 was constructed and expressed. The results of antifungal activity test revealed that the total protein extract of Escherichia coli containing SNP-D4 expression could specifically inhibite up to 19.60% of the germination rate for F. oxysporum FOC4. Collectively， our present study implied that the artificial pepaptamer SNP-D4 could be applied to develop environment-friendly biological agents for the control of specific fungal disease， offering a new technique for the prevention and control of banana fusarium wilt.

Key words banana fusarium wilt；pepaptamers；Fusarium oxysporum；vector construction；antifungal activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.022

香蕉枯萎病是一種侵染香蕉植株維管束的真菌引起的土傳病。由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubense，F(xiàn)OC）真菌侵染香蕉根部引起的土傳維管束病害[1]，難以根治，對香蕉產(chǎn)業(yè)造成了毀滅性危害[2]。其中尖孢鐮刀菌4號生理小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4，F(xiàn)OC4）的毒力和致病能力都遠(yuǎn)超其他生理小種[3]，且具有極強的抗逆性，可在土壤中存活20 a之久[4]，會常造成大面積毀園[5]，是威脅我國香蕉產(chǎn)業(yè)的主要因素之一。尖孢鐮刀菌以菌絲體、大型分生孢子和小型分生孢子的形式附著于根系表皮細(xì)胞[6]，通過分泌一系列毒素破壞根系的膜結(jié)構(gòu)，造成植株代謝紊亂[7]，感染后期可直接侵染植株維管束，導(dǎo)致維管束木質(zhì)化[8]。目前，對香蕉枯萎病仍缺乏有效的防護(hù)措施[9]，相關(guān)的防治研究主要集中在化學(xué)農(nóng)藥篩選方面，也有部分研究者尋找有效的生物防治手段[10]。

肽適體（peptide aptamer或pepaptamers）是一種篩選自人工合成的隨機氨基酸文庫，可高特異性、高親和力結(jié)合靶標(biāo)蛋白質(zhì)的短肽[11]。其主要結(jié)構(gòu)包括一段結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的支架蛋白（scaffold protein）和兩端固定在支架蛋白上的可變肽段[12]（圖1），其中的可變肽段通常由8～20個氨基酸組成，具有識別和結(jié)合特異靶蛋白的能力。人工肽適體的篩選和應(yīng)用是目前生物抗菌劑研發(fā)的熱點，其具有以下3個方面優(yōu)勢：第一，靶標(biāo)特異性極高，可以區(qū)分同一蛋白家族的不同成員；其二，分子量較抗體小，但對靶蛋白的識別與結(jié)合能力與抗體相當(dāng)；其三，體內(nèi)可折疊為穩(wěn)定的三級構(gòu)象，與一般的游離氨基酸相比更有利于保持較高生物學(xué)活性[13]。

目前肽適體在腫瘤治療[14]、食品安全[15]、植物生物技術(shù)[16]等方面中的巨大潛力已被發(fā)現(xiàn)[17]。在植物病害防治中的應(yīng)用主要是作為植物病毒的干擾劑，通過阻斷病毒感染周期的特定環(huán)節(jié)阻礙病毒感染植物[18]。Rudolph等[19]以番茄斑萎病毒的核衣殼為靶標(biāo)篩選到肽適體，轉(zhuǎn)化煙草Nicotiana benthamiana中，使其同時對番茄斑萎病毒 （TSWV）、番茄退綠葉斑病毒（TCSV）， 花生環(huán)斑病毒 （GRSV）， 菊花莖部壞疽病毒（CSNV）等產(chǎn)生抗性。

利用肽適體防治植物真菌病害的研究還有待開拓。本實驗室前期以改造的葡萄球菌核酸酶（Staphylococcal Nuclease，SNase，下文簡稱SN）為支架蛋白，將可編碼16個隨機氨基酸的文庫DNA插入SNase中，獲得系列質(zhì)粒pTRG-SNase-peptide（簡稱pTRG-SNP，后文中SNase-peptide均縮寫為SNP），構(gòu)成一個庫容量約為1.5～2.0×107 的肽適體文庫，同時構(gòu)建了僅表達(dá)肽適體支架蛋白的pTRG-SN質(zhì)

粒[20]。本研究通過尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)試驗，直接篩選肽適體文庫，獲得能夠特異性抑制尖孢鐮刀菌的人工肽適體SNP-D4，通過體外表達(dá)SNP-D4并進(jìn)行抑菌活性檢測，證明人工肽適體SNP-D4能夠特異性抑制尖孢鐮刀菌孢子的萌發(fā)。本研究的結(jié)果為研發(fā)抗尖孢鐮刀菌的生物抗菌劑提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和病原菌 供試菌株：大腸桿菌reporter，大腸桿菌BL21（DE3）。病原菌：尖孢鐮刀菌熱帶四號小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4，F(xiàn)OC4）。以上菌株均由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.0 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水100 mL， pH 7.0，121 ℃滅菌20 min； LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加瓊脂糖1.5 g即成，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；0.3%營養(yǎng)液：葡萄糖0.3 g，酵母提取物0.3 g，胰蛋白胨0.03 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 肽適體文庫的篩選 將肽適體文庫轉(zhuǎn)入制備好的大腸桿菌reporter感受態(tài)細(xì)胞中，分離單菌落并使用特異性引物F1和R1驗證，之后分別保存菌種。將保存的菌株分別接種至5 mL含四環(huán)素（Tet，終濃度50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min搖床過夜；按1%接種量將菌液接種至20 mL的LB液體培養(yǎng)基（含Tet，終濃度50 μg/mL）中，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，簡稱IPTG，終濃度100 μmol/L），15 ℃，150 r/min誘導(dǎo)過夜。收集菌體，用4 mL 50 mmol/L磷酸緩沖溶液（Phosphate Buffered Saline，簡稱PBS）懸浮，進(jìn)行超聲破碎。超聲5 s，間隙6 s，功率35%，共20 min。收集上清，即細(xì)菌全蛋白提取液。將10 μL轉(zhuǎn)入pTRG-SNP載體的reporter菌株細(xì)菌全蛋白提取液、10 μL 4×106個/mL尖孢鐮刀菌孢子懸液、10 μL 0.3%營養(yǎng)液混勻，同時以PBS處理作為空白對照，轉(zhuǎn)入pTRG-SN載體的reporter菌株的細(xì)菌全蛋白提取液作為陰性對照，0.3%惡霉靈處理作為陽性對照，不同處理組均在28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后于光學(xué)顯微鏡40×物鏡下觀察孢子萌發(fā)情況。

1.2.2 功能性肽適體的鑒定 將篩選到的菌株劃線活化，37 ℃培養(yǎng)過夜。每種菌株挑選3個單菌落，再次劃線活化，37 ℃培養(yǎng)過夜；挑單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基（含Tet，終濃度50 μg/mL）中，37 ℃ 250 r/min培養(yǎng)過夜；提取質(zhì)粒并測序。

1.2.3 重組載體構(gòu)建 利用目的片段特異性引物F2/R2擴增肽適體SNP-D4以及肽適體支架蛋白SN核苷酸序列，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的片段。將上述目的片段及pET28a空載體分別用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I進(jìn)行雙酶切，之后回收酶切產(chǎn)物。將上述酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接，得到連接產(chǎn)物。

1.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和陽性克隆子鑒定 將連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，之后涂布到含卡那霉素（Kan，終濃度50 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。之后挑取陽性克隆子，分別使用載體特異性引物F2/R2和目的片段特異性引物F3/R3進(jìn)行PCR驗證。最后將經(jīng)驗證的陽性克隆提取質(zhì)粒并測序。

1.2.5 重組蛋白的表達(dá) 將構(gòu)建重組載體陽性克隆接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基（含Kan，終濃度50 μg/mL），37 ℃，150 r/min搖床過夜；將活化的菌液按1%接種量接種至50 mL的LB液體培養(yǎng)基（含Kan，終濃度50 μg/mL）中；加入IPTG （終濃度100 μmol/L），15 ℃，150 r/min誘導(dǎo)過夜。

1.2.6 抑菌試驗 通過上述方法誘導(dǎo)重組菌株大量表達(dá)外源蛋白SN和SNP-D4之后，之后采用超聲波破碎獲得細(xì)菌全蛋白提取液，采用BCA法（使用GENEray公司的BCA法蛋白定量試劑盒）測定全蛋白濃度。將細(xì)菌全蛋白提取液蛋白濃度均稀釋至30 mg/mL，將10 μL細(xì)菌全蛋白提取液、10 μL 4×106個/mL尖孢鐮刀菌孢子懸液、10 μL 0.3%營養(yǎng)液混勻，同時以PBS處理組為空白對照，3組處理均在28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，在光學(xué)顯微鏡40×物鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，每組取3個不同的視野，觀察并統(tǒng)計萌發(fā)率。萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數(shù)/總孢子數(shù)×100%。重復(fù)3次取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗所得數(shù)據(jù)采用SAS 9.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肽適體文庫篩選

從肽適體文庫中分離鑒定得到32個肽適體單克隆。初步抑菌實驗結(jié)果顯示，在32個肽適體單克隆中，發(fā)現(xiàn)5種肽適體對尖孢鐮刀菌孢子具有抑制作用，其中SNP-D4效果最佳。從圖2中可看出，在相同處理時間下，PBS處理組與轉(zhuǎn)入pTRG-SN載體的reporter菌株的細(xì)菌全蛋白提取液處理組的孢子幾乎全部萌發(fā)，形成明顯的菌絲體，出現(xiàn)菌絲結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，說明PBS與轉(zhuǎn)入pTRG-SN載體的reporter菌株的細(xì)菌全蛋白提取液對孢子的萌發(fā)不具抑制作用，而SNP-D4處理組的孢子大多數(shù)未萌發(fā)，少數(shù)萌發(fā)的孢子的菌絲長度明顯短于陰性對照組，并未出現(xiàn)菌絲結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，其抑制效果幾乎與0.3%惡霉靈處理組相當(dāng)，說明SNP-D4本身對孢子的萌發(fā)具有一定抑制作用。

紅色圓圈標(biāo)記的為未萌發(fā)的孢子，紅色箭頭標(biāo)記的為萌發(fā)受到抑制的孢子。

為了確定具有孢子萌發(fā)抑制活性的SNP-D4的序列信息，提取表達(dá)SNP-D4的質(zhì)粒并測序，得到SNP-D4全長576 bp，編碼191個氨基酸，整體蛋白分子量大小為21 ku（圖3）。其編碼的可變肽段序列為共16個氨基酸（圖3中紅色邊框標(biāo)記的部分）。

2.2 人工肽適體SNP-D4原核表達(dá)載體構(gòu)建

通過菌落PCR驗證陽性轉(zhuǎn)化子擴增結(jié)果如圖4所示，表達(dá)SN的候選菌落使用2種引物擴增分別獲得724、537 bp的單一條帶，表達(dá)SNP-D4的候選菌落使用2種引物擴增分別獲得769、582 bp的單一條帶，而且PCR產(chǎn)物單一，無其他雜帶或污染，符合預(yù)期。提取重組質(zhì)粒并測序，將測序結(jié)果與SN和SNP-D4的核酸序列進(jìn)行比對，序列一致，表明已經(jīng)成功構(gòu)建可外源表達(dá)SN和SNP-D4的重組載體。

2.3 外源表達(dá)人工肽適體SNP-D4抑菌效果評估

通過抑菌實驗驗證外源表達(dá)人工肽適體SNP-D4的抑菌效果，孢子萌發(fā)率統(tǒng)計結(jié)果見圖5。從圖5可見，用表達(dá)人工肽適體SNP-D4的細(xì)菌全蛋白提取液處理時，尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率僅為19.60%，與之相比，用PBS處理時的萌發(fā)率為78.33%，二者之間差異極顯著（p<0.01），用肽適體支架蛋白SN的細(xì)菌全蛋白提取液處理時，孢子萌發(fā)率為72.10%，與空白對照PBS并未有顯著差異，表明本研究所篩選的人工肽適體SNP-D4能夠特異性抑制尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)。另外肽適體支架蛋白SN對尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)沒有顯著影響，說明發(fā)揮抑菌功能的是肽適體SNP-D4的可變肽段部分。

3 討論

香蕉枯萎病是香蕉產(chǎn)業(yè)的重要真菌病害之一，長期以來都引起人們的高度重視。目前可以用于防治香蕉枯萎病的化學(xué)藥劑包括惡霉靈、多菌靈[21]等。Borges 等[22]在枯萎病菌侵染前用甲萘醌亞硫酸氫鈉（一種維生素K）處理香蕉苗，發(fā)現(xiàn)處理后的香蕉苗中，植物抗毒素快速且大量合成，能夠延緩枯萎病癥狀的發(fā)生。但是，化學(xué)藥劑有效成分難以分離和鑒定，而且通常價格昂貴，并且化學(xué)藥劑的大量使用存在污染環(huán)境等問題。生物防治方面的研究主要包括篩選拮抗菌[23]、農(nóng)作物間作及輪作[24]等，其中拮抗菌是一種非常重要的防治手段。李載淵等[25]通過生長對峙實驗從五指山原始林區(qū)采集的土樣中選擇性分離得到702 株稀有放線菌，最終經(jīng)過復(fù)篩，獲得一株對尖孢鐮刀菌具有高活性的拮抗菌210-1-61。但是，拮抗菌也存在抑菌機理不清楚，以及破壞土壤微生物生態(tài)平衡等問題。因此，為了有效防止尖孢鐮刀菌引起的香蕉枯萎病，仍需要探索新型、環(huán)保的有效技術(shù)手段。

肽適體作為一種新型生物材料，被廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)方面，而其在生物農(nóng)藥方面主要是用作抗病毒制劑[26]。針對特定的生理功能分析，如病毒DNA復(fù)制復(fù)合體組裝等[27]，是通過篩選特定病毒靶標(biāo)具有高特異性的肽適體，達(dá)到干擾病毒功能的作用。本研究首次嘗試將肽適體應(yīng)用于抑制尖孢鐮刀菌，成功篩選到能夠特異性抑制香蕉枯萎病致病菌尖孢鐮刀菌的肽適體，并獲得其外源表達(dá)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，含有外源表達(dá)人工肽適體SNP-D4的細(xì)菌全蛋白提取液可將FOC4的孢子萌發(fā)率降低至19.60%，而人工肽適體的支架蛋白并未對孢子萌發(fā)率有顯著影響（處理后萌發(fā)率為72.10%），說明發(fā)揮抑菌功能的為人工肽適體SNP-D4可變肽段部分的16個氨基酸。綜上所述，人工肽適體SNP-D4能夠特異性抑制尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)，具有作為一種新型生物農(nóng)藥的潛力。

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