黔南州茶園土壤中優(yōu)勢(shì)菌株煙曲霉的分離·純化及鑒定

周小露 宋麗莎 王利榮

摘要[目的]分離一株適于開(kāi)發(fā)茶園專(zhuān)用有機(jī)肥的菌株。[方法]以黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，進(jìn)行微生物分離、純化、形態(tài)鑒定及分子鑒定。[結(jié)果]通過(guò)優(yōu)質(zhì)土壤的分離、純化得到優(yōu)勢(shì)菌株S2；該菌株邊緣薄，中心有不規(guī)則狀的條紋，表面呈絨毛狀，灰白色，背面淡青色；提取菌株S2 DNA，進(jìn)行凝膠電泳及PCR擴(kuò)增，經(jīng)BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，病原真菌的rDNA-ITS序列與Aspergillus fumigatus（JQ268555.1）的序列相似度高達(dá)100%。[結(jié)論]結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定，確定從茶園土壤中分離、純化得到的菌株為煙曲霉菌。

關(guān)鍵詞 煙曲霉；菌體形態(tài)；形態(tài)鑒定；分子鑒定

中圖分類(lèi)號(hào) S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）22-0115-04

Abstract[Objective]To isolate a strain suitable for the development of organic fertilizers for tea gardens.[Method]The highquality soil of tea gardens in Qiannan Prefecture was used as the material for microbial isolation，purification，morphological identification and molecular identification.[Result]The superior strain S2 was obtained through the separation and purification of highquality soil.The strain had a thin edge，irregular stripes at the center，and the surface was villous，grayish white and light blue on the back；the strain S2 DNA was extracted and subjected to gel electrophoresis and PCR amplification.After BLAST comparison，the sequence similarity of the rDNAITS sequence of pathogenic fungi to Aspergillus fumigatus （JQ268555.1） was as high as 100%.[Conclusion]According to the morphological and molecular biological identification，the strain isolated and purified from the tea garden soil was identified as Aspergillus fumigatus.

Key words Aspergillus fumigatus；Cell morphology；Morphological identification；Molecular identification

在貴州農(nóng)業(yè)中，茶葉占重要經(jīng)濟(jì)地位，截至2018年茶園面積達(dá)46萬(wàn)～67萬(wàn)hm2；其中黔南州種植面積為10萬(wàn)hm2，占貴州省茶園總面積的21%，是重要茶區(qū)之一。黔南州《關(guān)于進(jìn)一步加快推進(jìn)茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的意見(jiàn)》明確提出有機(jī)茶的發(fā)展目標(biāo)，在有機(jī)茶園建設(shè)過(guò)程中，必須提高無(wú)害化有機(jī)肥的投入，構(gòu)建茶園動(dòng)態(tài)植保體系。然而大量使用化學(xué)肥料會(huì)帶來(lái)土壤酸化、重金屬超標(biāo)、農(nóng)藥殘留等問(wèn)題。

研究表明，貴州茶區(qū)如都勻茶區(qū)[1-2]pH為3.00～4.00；湄潭和鳳岡pH為4.00～4.50；正安pH為4.00～5.00，土壤大面積酸化。茶樹(shù)缺少大量元素，植株矮小，產(chǎn)量降低。目前，可用于茶樹(shù)的生物有機(jī)肥較少，但使用化肥已對(duì)茶園造成嚴(yán)重危害，研制可供茶樹(shù)使用的生物有機(jī)肥迫在眉睫。

秸稈內(nèi)含有大量有機(jī)物，不僅可以增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，補(bǔ)充大量元素，而且是最常見(jiàn)的生物有機(jī)肥原料之一。生物有機(jī)肥的制造過(guò)程需大量使用秸稈，不僅可以使秸稈重歸田間，而且通過(guò)對(duì)秸稈的回收，有效避免了秸稈燃燒造成的大氣污染。

生物有機(jī)肥制作大多采用秸稈、微生物、腐殖質(zhì)等天然原料，具有無(wú)毒、無(wú)害、成本低、見(jiàn)效好等優(yōu)點(diǎn)，有機(jī)肥有效地利用天然原料，循環(huán)利用，變廢為寶。使用生物有機(jī)肥不僅不會(huì)造成土壤環(huán)境的危害，利用微生物還可以大大改善因大量使用化肥而造成的土壤酸化、重金屬超標(biāo)等問(wèn)題。

生物有機(jī)肥中有效菌種發(fā)酵產(chǎn)生的多種可溶性生理活性物質(zhì)，如有機(jī)酸、維生素等能被植物迅速吸收。施用有機(jī)肥[3-7]可降低土壤的酸化程度，有利于加快土壤中氮、磷等元素循環(huán)[8-11]，有助于緩解土壤酸化趨勢(shì)[12-14]，減少Cd等[15]重金屬的累積；促進(jìn)茶樹(shù)提早萌發(fā)[16]，茶葉長(zhǎng)勢(shì)良好，芽葉密度大，芽質(zhì)量明顯提高，增加了茶鮮葉中茶多酚、咖啡堿、水浸出物、可溶性糖的含量，茶葉氟含量明顯下降。

土壤是植物吸收養(yǎng)分的主要來(lái)源之一，通過(guò)給茶樹(shù)施肥能改良茶樹(shù)因缺少大量元素造成的葉片發(fā)黃等問(wèn)題。茶樹(shù)專(zhuān)用有機(jī)肥既可做基肥也可做追肥，速效與緩效養(yǎng)分協(xié)調(diào)，肥料利用率高，可減輕氮肥造成的硝酸鹽積累以及磷鉀肥造成的重金屬污染，因此都勻毛尖茶區(qū)專(zhuān)用有機(jī)肥的研制迫在眉睫。筆者以黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，分離、純化得到優(yōu)勢(shì)菌株，通過(guò)形態(tài)鑒定和分子鑒定，明確優(yōu)勢(shì)菌株的背景，以期為其茶園專(zhuān)用有機(jī)肥的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土樣：采集于都勻三江堰茶園；蔗糖：化學(xué)純，天津市密歐化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)責(zé)任有限公司；

磷酸二氫鉀：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖：分析純，天津市化學(xué)試劑公司；氯化鉀：分析純，汕頭市光華化學(xué)廠(chǎng)；硫酸鎂：分析純，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；其他材料：硝酸鈉，乙醇，氯霉素，硫酸鐵，蒸餾水，馬鈴薯，KAC，異丙醇，溴酚藍(lán)，液氮。

1.2 試驗(yàn)儀器

電子顯微鏡：XSP-8C，德卡精密量?jī)x（深圳）有限公司；超凈工作臺(tái)：SW-CJ1FDA，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：GI54DS，致微（廈門(mén)）儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱：BIC-250，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；冰箱：BCD-251WBSV，上海帝覽實(shí)業(yè)有限公司；電子天平：LTI000B，常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司；其他儀器：保鮮膜，濾紙，酒精燈，取樣袋，蓋玻片，載玻片，玻璃棒，燒杯，紗布，量筒，鑷子，接種環(huán)，涂布棒，記號(hào)筆，鏟子，藥匙，報(bào)紙，橡皮筋，培養(yǎng)皿，試管，三角瓶，一次性手套，標(biāo)簽紙。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 預(yù)處理。為了減少土壤樣品中的雜物，防止其他物質(zhì)菌體的干擾，用滅菌過(guò)后的菌鑷子夾出草、石頭等物質(zhì)，再把處理好的土壤放入-5 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 培養(yǎng)基配制。

①PDA：洋芋200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min。②PSA：洋芋200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min。③WA：瓊脂粉13 g，蒸餾水1 000 mL。④察氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g，七水合硫酸鎂0.5 g，硝酸鈉2 g，氯化鉀0.5 g，七水合硫酸亞鐵0.01 g，磷酸二氫鉀1.0 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3.3 菌株分離。①取土樣。在都勻三江堰茶園中，挑選優(yōu)質(zhì)土壤，用鏟子挖出，裝入密封袋中，用標(biāo)簽紙貼好并編號(hào)，帶入實(shí)驗(yàn)室以便制作菌種懸液。

②材料消毒。防止帶回土壤被周?chē)h(huán)境中的菌種污染，試驗(yàn)操作要求在無(wú)菌條件下進(jìn)行。提前2 h將制備的培養(yǎng)基、試驗(yàn)所用工具和蒸餾水（制備稀釋濃度梯度的無(wú)菌水）放入高壓滅菌鍋中滅菌，以使用。③土樣稀釋。取20 g土壤放入三角瓶中，裝入80 mL無(wú)菌水，搖晃20 min，制備菌種原懸液；再依次稀釋得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度梯度的菌種懸液（圖1）。④涂布接種。在酒精燈周?chē)?，用接種環(huán)蘸取1～2滴菌種懸浮液，使用涂布法在已制備的培養(yǎng)基中接種，并將接種濃度用標(biāo)簽紙?jiān)谂囵B(yǎng)皿上記錄。試驗(yàn)完成后，整理并關(guān)閉超凈工作臺(tái)，把已接種的培養(yǎng)基放入25 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6～7 d。直至有菌落形成時(shí)，即可對(duì)菌株進(jìn)行純化。

1.3.4 菌株純化。

①準(zhǔn)備。培養(yǎng)至第6天，在培養(yǎng)基上可明顯觀察到菌落。挑選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛的菌落，使用涂布平板劃線(xiàn)法進(jìn)一步純化處理。

②接種。首先在培養(yǎng)皿底部用記號(hào)筆畫(huà)出等邊的頂點(diǎn)3個(gè)點(diǎn)，并標(biāo)號(hào)。落點(diǎn)時(shí)注意在酒精燈周?chē)僮鳎劝呀臃N環(huán)在酒精燈上灼燒2～3 s，待接種環(huán)溫度降低，即可把接種環(huán)放入培養(yǎng)基中降溫，防止較高溫度殺死菌種。用接種環(huán)沾取菌，從標(biāo)記的第1個(gè)點(diǎn)開(kāi)始落點(diǎn)后，繼續(xù)朝第2個(gè)點(diǎn)，接著再朝第3個(gè)區(qū)域點(diǎn)，以此類(lèi)推。

③培養(yǎng)。將接種優(yōu)勢(shì)菌的PDA培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)3～5 d。經(jīng)培養(yǎng)后，每個(gè)皿形成3個(gè)菌落。

④觀察。待優(yōu)勢(shì)菌長(zhǎng)出菌落后，觀察優(yōu)勢(shì)菌長(zhǎng)勢(shì)是否良好，如果有雜菌需要再進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。

1.3.5 菌株鑒定。

1.3.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定。

①鏡檢鑒定。在察氏或PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，待菌株產(chǎn)生孢子結(jié)構(gòu)時(shí)，在菌落邊緣和中間挑取少許菌落，制成標(biāo)本，并固定好，利用電子顯微鏡在40倍和100倍顯微鏡下對(duì)菌種進(jìn)行觀察，并記錄菌種的相關(guān)特征，根據(jù)菌落的形狀、大小、顏色、表面特征來(lái)鑒定，初步判斷該菌種的種類(lèi)。

②生長(zhǎng)速率的測(cè)定。在無(wú)菌環(huán)境下，把優(yōu)勢(shì)菌株打成直徑5 mm的菌餅，轉(zhuǎn)移至25 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d后，量取優(yōu)勢(shì)菌餅直徑的大小，比較其變化，即可計(jì)算優(yōu)勢(shì)菌的生長(zhǎng)速率，并記錄優(yōu)勢(shì)菌的生長(zhǎng)特征。

1.3.5.2 分子鑒定。

（1）DNA的提取。①研磨菌絲，加入500 μL 裂解液，放置10 min；②加入濃度3 mol/L的KAC 150 μ L，12 000 r/min 離心15 min，取其上清；③重復(fù)②，取上清液并加入異丙醇，在12 000 r/min 下離心15 min；④取其上清，加300 μL 70%乙醇沉淀DNA，在12 000 r/min下離心10 min，洗滌2～3次；⑤等待水分散失，加0.1×TE 30 μL，最終獲得液體狀態(tài)下的DNA。

（2）PCR擴(kuò)增。以ITS2的5′- TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′作為引物（5′- TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′，由華大基因生物技術(shù)有限公司合成），擴(kuò)增體系總體積為25.000 μL（DNA模板1.000 μL、10× buffer緩沖液體2.500 μL、dNTPs 2.000 μL、正向引物1.000 μL、反向引物1.000 μL、Ex Taq DNA聚合酶0.125 μL、ddH2O 17.400 μL），以體系中不加菌株DNA提取物作為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成取出產(chǎn)物保存于4 ℃冰箱，備用。

（3）電泳。①制膠。稱(chēng)0.2 g瓊脂糖，加20 mL 0.5 TBE緩沖液（pH 8.0），用微波爐加熱1.5 min，拿出瓊脂糖溶液，靜置一段時(shí)間后，加入1 μL Goldview指示劑，搖勻；插好梳子，穩(wěn)定模具，把凝膠倒入制膠模具。②電泳。將制膠板置于電泳槽中。取5.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入2.5 μL溴酚藍(lán)，混勻后點(diǎn)樣。開(kāi)啟設(shè)備，設(shè)定電壓（120 V）和時(shí)間（30 min）。

試驗(yàn)結(jié)束后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因生物技術(shù)有限公司（廣州部）測(cè)序。

（4）序列分析。把測(cè)序得到的序列放到National Center for Biotechnology Information（NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast檢測(cè)，下載優(yōu)勢(shì)菌株的序列。將優(yōu)勢(shì)菌株的序列導(dǎo)入MEGA 6.0軟件，使用多序列比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，鑒定菌株種別。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢(shì)菌分離

以?xún)?yōu)質(zhì)土壤（圖2）為材料，利用稀釋涂布分離得到5種菌；進(jìn)一步利用3點(diǎn)接種法，純化該菌株，最終得到優(yōu)勢(shì)菌株S2（圖3），該菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃下培養(yǎng)4～6 d長(zhǎng)勢(shì)旺盛，同時(shí)該菌株生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)。

2.2 優(yōu)勢(shì)菌鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定。

利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法，對(duì)“2.1”分離、純化得到的優(yōu)勢(shì)菌株S2進(jìn)行觀察。利用電子顯微鏡觀察，優(yōu)勢(shì)菌種S2邊緣薄，中心有不規(guī)則狀的條紋，生長(zhǎng)表面呈絨毛狀，灰白色或乳白色，培養(yǎng)基為淺綠色到灰白色，背面淡青色；向上突起的菌絲在球形頂囊上分生出粗糙的孢子梗，孢子梗中長(zhǎng)出許多分生孢子，頂囊為半球狀，在1/2或1/3處有雙層小梗；分生孢子頭呈放射狀，大小為1.5～2.5 nm。小梗雙層，?；?.5～1.0 nm，小梗1.0～1.5 nm，分生孢子球形，粗糙，直徑1.0～1.5 nm或稍大。菌落大小為4.0～8.6 nm。根據(jù)優(yōu)勢(shì)菌株S2的形態(tài)特征，初步確定該菌屬為曲霉屬真菌（圖4）。

2.2.2 分子鑒定。

提取菌株S2 DNA，進(jìn)行凝膠電泳及PCR擴(kuò)增得到1條946 bp的清晰條帶（圖5），將此PCR產(chǎn)物測(cè)序后提交至GenBank中，經(jīng)BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，病原真菌的rDNA-ITS序列與Aspergillus fumigatus（JQ268555.1）的序列相似度高達(dá)100%。依據(jù)比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖6），表明該菌應(yīng)為Aspergillus Caesiellus。

再結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定，確定從茶遠(yuǎn)土中分離純化出的菌為曲霉屬煙曲霉菌Aspergillus fumigatus。其屬于真菌界 Mycota真菌門(mén) Eumycophyta半知菌亞門(mén)Deuteromycotina半知菌綱 Sphaeropsidales殼霉目 Discellaceae杯霉科 Aspergullus niveus曲霉屬 Aspergillus煙曲霉 Aspergillus fumigatus。

3 結(jié)論與討論

（1）該研究取黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，對(duì)其進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢⑵錁悠窇乙和坎加谂囵B(yǎng)皿培養(yǎng)得到多種菌種，并對(duì)菌種進(jìn)行分離，再挑取菌種純化得到優(yōu)勢(shì)菌株S2。

為了明確優(yōu)勢(shì)菌株的背景，對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株S2的鑒定主要采用傳統(tǒng)的生物形態(tài)學(xué)鑒定法，利用電子顯微鏡進(jìn)行觀察，初步確定該優(yōu)勢(shì)菌株S2為Aspergillus曲霉屬。生物形態(tài)鑒定法鑒定品種的形態(tài)特征很有限，同時(shí)還受觀察時(shí)段的影響，并且這些性狀適用于某些品種間差異明顯的樣品鑒定，因此在實(shí)用中存在一定的局限性。

為了更好地明確優(yōu)勢(shì)菌株的背景，再采用分子鑒定法對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株S2進(jìn)行鑒定，分子鑒定法的優(yōu)點(diǎn)： ITS序列的保守性大體上表現(xiàn)為與其種屬相對(duì)一致，ITS的種間差異較明顯，能精確地反映種間及菌株間的堿基對(duì)差異； ITS序列的片段較小，更有利于分析真菌種屬之間的發(fā)育；ITS序列分析在很大程度上彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)特征分析的很多不足。結(jié)合形態(tài)鑒定和分子鑒定可確認(rèn)優(yōu)勢(shì)菌株S2為曲霉屬煙曲霉菌Aspergillus fumigatus。

（2）微生物是土壤的重要組成部分，在土壤中起著至關(guān)重要的作用，該研究煙曲霉參與茶樹(shù)特制有機(jī)肥研發(fā)，可調(diào)節(jié)肥料的養(yǎng)分，提高肥料利用率，還可減緩硝酸鹽的積累和重金屬污染。關(guān)于用曲霉屬真菌作為生物有機(jī)肥的研究很少，曲霉屬真菌對(duì)于茶樹(shù)有無(wú)益處還有待進(jìn)一步研究。雖然在根系土壤中含有的大量曲霉目前尚未有相關(guān)的益、弊研究，可以確定的是相關(guān)曲霉可以改善土壤，今后可在曲霉方面進(jìn)一步研究。

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