酶水解法制備芝麻蛋白工藝條件優(yōu)化

畢雙同 藍海軍

摘要 [目的]對酶水解法制備芝麻蛋白工藝條件進行優(yōu)化。[方法]在對芝麻蛋白溶解度研究的基礎(chǔ)上，確定了以芝麻粕為原料，利用纖維素酶水解制備芝麻蛋白的工藝流程。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析確定纖維素酶法水解制備芝麻蛋白的最佳工藝條件。[結(jié)果]纖維素酶法水解制備芝麻蛋白的最佳工藝條件為酶用量1 200 U/g，溫度為56 ℃，pH為5.1，酶解時間為2.4 h。在此條件下芝麻蛋白提取率為83.87%。[結(jié)論]該研究為芝麻蛋白提取探索了新的工業(yè)化生產(chǎn)途徑。

關(guān)鍵詞 芝麻蛋白；纖維素酶；溶解度；芝麻粕；響應(yīng)面

中圖分類號 TS201.2+1 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）21-0166-03

Abstract [Objective]To optimize the technological condition for preparation of sesame protein by enzymatic hydrolysis.[Method]Experiments were made to determine about technological process of preparation of sesame protein from sesame oil meal by enzymatic hydrolysis based on the study of sesame proteins dissolvability.The technological conditions for preparation of sesame protein by hydrolysis with cellulase were optimized by response surface based on the single factor experiment.[Result]The extraction rate of sesame protein was 83.87% under the optimal technological condition which digested with 1 200 U/g enzyme for 2.4 h at pH 5.1，56 ℃.[Conclusion]This study explored new industrialized production pathways for sesame protein extraction.

Key words Sesame protein；Cellulase；Dissolvability；Sesame oil meal；Response surface

芝麻蛋白氨基酸組成與聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）、世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的人類蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)具有很好的一致性，其蛋白質(zhì)凈利用率（NPU）為56，蛋白質(zhì)功效比值（ PER） 為1.8，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白[1]，可作為蛋白質(zhì)和含硫氨基酸強化劑，以彌補大豆蛋白的不足。芝麻蛋白具有良好的乳化性、乳化穩(wěn)定性、吸油性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性等功能特性，可以在食品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[2-3]。由于投資成本問題，目前國內(nèi)芝麻油加工廠家尤其是中小型企業(yè)大多采用壓榨方式提取芝麻油，經(jīng)測定芝麻榨油后副產(chǎn)品芝麻粕中蛋白含量為42%以上，但目前主要作為飼料，市場售價為2 000～3 000元/t，這種利用方式導(dǎo)致芝麻產(chǎn)品附加值較低，造成了大量蛋白質(zhì)資源浪費。因為芝麻蛋白70%以上為堿溶性蛋白，所以提取采用的方法大多是堿提酸沉法[4]。但是高濃度堿液長時間提取條件會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和水解，對氨基酸有破壞作用，加劇了美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生黑褐色物質(zhì)。同時，堿法提取過程中還存在著固液比大、對設(shè)備腐蝕性大、大量廢水對環(huán)境造成污染等問題[5]。酶法提取蛋白質(zhì)的研究主要有2種：一是利用酶分解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、淀粉等非蛋白類物質(zhì)，使蛋白質(zhì)溶出[6]；二是利用蛋白質(zhì)酶將蛋白質(zhì)水解成多肽，從而使大部分蛋白類物質(zhì)溶出[7]。筆者以芝麻榨油后副產(chǎn)品芝麻粕為原料，通過利用纖維素酶分解芝麻細胞壁中木質(zhì)素、纖維素等物質(zhì)，而后利用酶解加堿溶的方法進行芝麻蛋白的提取研究，以期為芝麻蛋白提取探索新的工業(yè)化生產(chǎn)途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料 芝麻粕（芝麻油生產(chǎn)廠家），壓榨芝麻粕，烘干、粉碎，過60目篩；食品級纖維素酶（Novozyme公司）；NaOH、HCl等均為分析純。

1.2 主要儀器和設(shè)備 紫外-可見分光光度計、恒溫水浴鍋、粉碎機、攪拌器、XHF-1高速分散儀、電子天平、真空干燥箱、離心機、pH計等。

1.3 研究方法 比較酶解、堿溶與酶解+堿溶3種處理過程的蛋白提取率，選定最佳的處理過程。芝麻粕經(jīng)烘干、粉碎（過60目篩）后，在反應(yīng)器中與一定比例水混合，加入適量纖維素酶，在適宜pH和溫度條件下酶解一定時間后，調(diào)整溶液pH，攪拌一定時間，使蛋白最大程度溶解于溶液中，溶液過濾處理后將濾液調(diào)節(jié)至酸性，靜置后離心處理，將沉淀物真空干燥后粉碎，從而得到芝麻蛋白粉。

研究溶液pH和溫度對蛋白溶解度的影響，確定纖維素酶水解提取芝麻蛋白工藝流程后，以蛋白提取率為指標(biāo)，開展了酶用量、溫度、pH、酶解時間的單因素試驗，并選用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合進行響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化提取工藝參數(shù)。

1.4 統(tǒng)計與測定

1.4.1 蛋白溶解度測定。稱取4.2 g芝麻蛋白，分散于90 mL水中，用HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)至所需pH，并在不同溫度水浴中低速攪拌溶解，30 min后取出離心，測定上清液及樣品蛋白含量。蛋白溶解度=上清液蛋白含量/樣品蛋白含量×100%。

1.4.2 蛋白提取率計算。蛋白提取率=（WT/W0）×100%，式中WT為提取后在80 ℃、10 h條件下烘干的蛋白質(zhì)量，W0為在80 ℃、10 h條件下烘干的芝麻粕質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻蛋白溶解度

2.1.1 溶液pH對芝麻蛋白溶解度的影響?？疾煸谌芤簆H為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的條件下，芝麻蛋白溶解度的變化情況。由圖1可知，芝麻蛋白的等電點在pH 4.5附近，蛋白溶解度隨著溶液pH的增加而增大，在溶液pH為10.0的條件下，蛋白能夠完全溶解于溶液。

2.1.2 溶液溫度對芝麻蛋白溶解度的影響?？疾煸谌芙鉁囟葹?0、40、50、60、70、80、90 ℃的條件下，芝麻蛋白溶解度的變化情況。由圖2可知，在溫度為50～60 ℃時，芝麻蛋白的溶解度最大，這與銀玉容等[8]、李秀涼等[9]的研究結(jié)果相近，溫度的增加起到增溶作用，但溫度過高則引起蛋白質(zhì)變性，促進蛋白質(zhì)分子間的相互結(jié)合而凝結(jié)沉淀，所以芝麻蛋白最佳溶解溫度為50～60 ℃。

2.1.3 酶解、堿溶與酶解+堿溶3種處理過程的蛋白提取率。

由圖3可知， 單獨酶解時蛋白提取率為19.0%，單獨堿溶時蛋白提取率為27.3%，而酶解+堿溶的蛋白提取率為74.7%。芝麻細胞壁約90%是纖維素、半纖維素和果膠等多糖類物質(zhì)，纖維素酶是一種以纖維素酶為主體包含半纖維素酶、果膠酶的復(fù)合酶體系，能很快使植物細胞壁崩潰，有利于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放和降解。纖維素酶的酶解最適pH在4.0～6.0，由“2.1.1”結(jié)果可知，此時溶液不利于蛋白質(zhì)溶出，導(dǎo)致蛋白提取率低。堿溶過程中，堿液濃度和時間均未達到最佳堿提條件，所以蛋白提取率也很低。酶解+堿溶提取法在酶水解細胞壁釋放蛋白質(zhì)后，通過弱堿性溶液使蛋白質(zhì)溶出，增加了蛋白提取率，而且短時間弱堿性溶液處理也不會使蛋白質(zhì)變色。所以，該試驗確定的纖維素酶法提取芝麻蛋白質(zhì)的工藝流程是：芝麻粕→預(yù)處理→固液混合→酶水解→堿溶解→過濾→等電點沉淀→離心→高溫滅酶→真空干燥→芝麻蛋白，其中：堿溶過程pH為10.0，溶液溫度為50 ℃，時間為30 min。

2.2 纖維素酶法提取芝麻蛋白單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶用量對蛋白提取率的影響。考察在纖維素酶用量為400、800、1 200、1 600、2 000、2 400 U/g條件下芝麻蛋白提取率變化情況。由圖4可知，芝麻蛋白提取率隨著纖維素酶用量的增加而增大，但是在酶用量為1 200 U/g之后繼續(xù)增加酶用量，蛋白提取率增幅不明顯，所以纖維素酶法提取芝麻蛋白的最佳酶用量是1 200 U/g左右。

2.2.2 溫度對蛋白提取率的影響?？疾煸谔崛∫簻囟葹?0、45、50、55、60、65 ℃條件下，芝麻蛋白提取率變化情況。由圖5可知，在45～55 ℃溫度范圍內(nèi)，芝麻蛋白提取率隨著溫度的升高而增大，但是在55～65 ℃溫度范圍內(nèi)，提取率隨溫度的升高而降低，所以纖維素酶法提取芝麻蛋白的提取液最佳溫度是55 ℃左右。

2.2.3 pH對蛋白提取率的影響?？疾焯崛∫簆H為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5條件下芝麻蛋白提取率變化情況。由圖6可知，在pH為4.0～5.5范圍內(nèi)，芝麻蛋白提取率隨著pH的增加而增大，但是在pH為5.5～6.5范圍內(nèi)，蛋白提取率隨pH的增加而減小，所以纖維素酶法提取芝麻蛋白的提取液最佳pH為5.5左右。

2.2.4 酶解時間對蛋白提取率的影響?？疾煸诿附鈺r間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h的條件下芝麻蛋白提取率的變化情況。由圖7可知，芝麻蛋白提取率隨酶解時間的增加而增大，但酶解2.0 h之后繼續(xù)增加酶解時間，蛋白提取率的增幅不明顯，所以酶法-堿溶提取芝麻蛋白的最佳酶解時間是2.0 h左右。

2.3 纖維素酶法提取芝麻蛋白工藝條件優(yōu)化

2.3.1 提取條件的優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定各因素較優(yōu)的取值水平后，運用Design-Expert軟件，以蛋白提取率（Y）為響應(yīng)值，以酶用量（A）、溫度（B）、pH（C）、酶解時間（D）為自變量，采用四因素三水平的響應(yīng)面試驗，共29個響應(yīng)面分析試驗（5個零點試驗）。因素水平設(shè)計見表1。酶用量分別與其他因素交互作用及響應(yīng)面、等值線見圖8～10。

運用軟件計算得出A、B、C、D四個因素對Y的回歸方程是：

Y=83.24+6.04A+1.42B+2.01C+3.21D-0.75AB-0.50AC+0.38AD+0.02BC-4.08A2-3.76B2-5.76C2-2.08D2

方差分析可知，模型的P<0.000 1，表明該模型的回歸是高度顯著的；該回歸方程決定系數(shù)R2=0.992 0，說明回歸方程與試驗情況擬合良好；失擬項P為0.467 7，不顯著，表明殘差由隨機誤差產(chǎn)生。因此，該模型回歸方程可以用于分析和預(yù)測試驗指標(biāo)與各試驗因素之間的關(guān)系。同時，由方差分析可知，試驗中4個因素對蛋白提取率的影響主次關(guān)系是：酶用量、酶解時間、pH、溫度。

2.3.2 數(shù)學(xué)模型的驗證試驗結(jié)果。運用軟件，在固定酶用量條件下按照最大提取率做進一步分析，此時模型最大預(yù)測值為84.78%，條件為酶用量1 200 U/g，溫度為56 ℃，pH為5.1，酶解時間為2.4 h。按照模型預(yù)測條件進行3次平行驗證試驗，芝麻蛋白提取率為83.87%。與預(yù)測值相差1%，證明了用響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶水解提取芝麻蛋白工藝條件是可行的，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

芝麻蛋白的等電點在pH 4.5左右，溶液pH和溶解溫度對芝麻蛋白溶解度影響較大，調(diào)整提取液pH為10.0、溫度為55 ℃，有利于芝麻蛋白溶解，可以增加提取效果。

以芝麻粕為原料，利用纖維素酶法提取芝麻蛋白，以蛋白提取率為指標(biāo)，在單因素試驗基礎(chǔ)上運用響應(yīng)面法優(yōu)化分析，通過結(jié)果分析表明酶用量對蛋白提取率影響較大，其次為酶解時間、pH和溫度。纖維素酶法提取芝麻蛋白的最佳工藝參數(shù)為酶用量1 200 U/g，溫度為56 ℃，pH為5.1，酶解時間為2.4 h。在此條件下芝麻蛋白提取率為83.87%。

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