唾腺染色體制片方法的簡化與改進(jìn)

黃世全 王棚濤 郭思義

摘要 以果蠅、日蠅及其3齡幼蟲為研究對(duì)象，采用先染色后分離唾腺組織的方法簡化了唾腺染色體的制備過程。通過比較發(fā)現(xiàn)，日蠅可能是更適合

制備唾腺染色體的試驗(yàn)材料。

關(guān)鍵詞 果蠅；日蠅；唾腺染色體；遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)

中圖分類號(hào) S-01 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）21-0234-03

Abstract Taking Drosophila melanogaster，Heleomyzidae and their thirdinstar larvae as research objects，the preparation process of salivary gland chromosome was simplified by using the method of firstly staining and then separating the salivary gland tissue.The results indicated Heleomyzidae might be more suitable for preparing salivary gland chromosome than other experimental materials.

Key words Drosophila melanogaster；Heleomyzidae；Salivary gland chromosome；Genetics experiments

唾腺染色體最早是1881年意大利細(xì)胞學(xué)家Balbiani在搖蠅幼蟲中發(fā)現(xiàn)的一種巨大染色體，由于存在于唾液腺細(xì)胞中，所以稱為唾腺染色體（salivary gland chromosome），是染色體常染色質(zhì)區(qū)的核蛋白纖維不斷復(fù)制，但復(fù)制產(chǎn)物不分開，成千上萬條染色質(zhì)纖維平行排列成寬大的帶狀物，又稱多線染色體（polytene chromosome），比一般染色體粗1 000～2 000倍，長100～200倍[1]。果蠅唾腺染色體制片與觀察是遺傳學(xué)教學(xué)的典型實(shí)驗(yàn)之一?，F(xiàn)今普遍采用的唾腺染色體制備方法是壓片法[2]。長期以來，許多研究者對(duì)該實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了不斷優(yōu)化，近幾年又有研究者從果蠅的培養(yǎng)方法、果蠅唾腺體的剝?nèi)?、?shí)驗(yàn)過程中的解離處理、不同染色劑的比較以及后期圖片的處理等方面做了改進(jìn)[1，3-12]。這些研究中實(shí)際操作都比較繁瑣，忽視了唾腺染色體“巨大”這個(gè)特點(diǎn)，唾腺細(xì)胞核也比其他細(xì)胞大，因此只要稍作染色，就能將果蠅唾腺體從頭部組織的口器、脂肪和食道管中分離開。此外，唾腺染色體普遍存在于蠅科幼蟲中，蠅科其他種可能也是唾腺染色體制片的優(yōu)秀材料。筆者對(duì)唾腺染色體制片方法進(jìn)行了簡化與改進(jìn)，旨在為唾腺染色體的研究和實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 果蠅及其3齡幼蟲、日蠅及其3齡幼蟲。

1.2 試劑 1%醋酸洋紅，采用常規(guī)方法配制。稱取1 g洋紅，加到100 mL 45%的醋酸溶液中，煮沸約5 min，懸入一生銹小鐵釘1 min，冷卻過濾并保存于棕色瓶中備用。

1.3 器材 顯微鏡、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、濾紙。

1.4 試驗(yàn)方法

①取果蠅和日蠅3齡幼蟲置于載玻片上，用鑷子夾住幼蟲的尾部，用解剖針按住幼蟲頭部，輕輕拉出幼蟲的口器，帶出唾腺及其他組織。②滴加1滴1%的醋酸洋紅，染色約1 min后，置于顯微鏡載物臺(tái)上，使用4倍物鏡觀察唾腺組織，剔除口器、脂肪、食道管等其他組織部分。如果這些組織與唾腺組織聯(lián)結(jié)比較緊密，可用解剖針剖解，再去除非唾腺組織部分。③對(duì)著唾腺組織蓋上蓋玻片，蓋玻片一角墊上雙面刀片，按住另一邊，用鑷子輕敲幾下，去掉刀片，蓋上濾紙，垂直壓片后，即可使用顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 唾腺染色體制片方法的簡化

日蠅和果蠅同屬雙翅目，日蠅成蟲比果蠅大（圖1、2），3齡幼蟲也比果蠅大。無論是果蠅3齡幼蟲還是日蠅3齡幼蟲都很容易制備出唾腺染色體裝片。3齡幼蟲頭部被拉出并染色約1 min后，在4倍物鏡下可見清晰的頭部組織，包括口器、脂肪、唾腺、食道管等，其中唾腺組織是由許多大型唾腺細(xì)胞組成，細(xì)胞中間是染色比較深的細(xì)胞核，核內(nèi)即為唾腺染色體，其他組織的細(xì)胞核比較小，因此很容易將唾腺組織與其他組織區(qū)分開來，便于剝離（圖3、4）。用解剖針移除口器和食道管，留下唾腺組織及其附著的少量脂肪（圖5、6），發(fā)現(xiàn)日蠅的唾腺組織比果蠅大。經(jīng)壓片后，在40倍物鏡下能清晰地觀察到唾腺染色體的圖像，由于去除了口器和食道管等組織的混雜，所以圖片背景比較清晰（圖7、8）。這說明這種方法適用于果蠅和日蠅唾腺染色體的制片與觀察，尤其是實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

2.2 唾腺染色體制片材料的優(yōu)化 在實(shí)驗(yàn)過程中有時(shí)候拉出來的3齡幼蟲頭部組織排布比較規(guī)則（圖3、4），從形態(tài)上也可以將唾腺組織與口器、脂肪和食道管區(qū)分開。如果拉出的頭部組織排布不規(guī)則，唾腺組織和食道管就很難辨認(rèn)，經(jīng)過染色后，根據(jù)唾腺組織細(xì)胞核大、染色深等特點(diǎn)，比較容易將其與食道管區(qū)分（圖9、10）。日蠅無論是成蟲還是幼蟲都比果蠅大，分離唾腺組織時(shí)比較容易操作，壓片后唾腺染色體相差不大。自然環(huán)境中日蠅比較多，容易誘捕和培養(yǎng)。因此，在唾腺染色體制片和觀察實(shí)驗(yàn)課中，選用日蠅作為實(shí)驗(yàn)材料比果蠅更為理想。

3 結(jié)論與討論

3.1 唾腺染色體制片方法的簡化與改進(jìn) ①省略了一些器具和藥品。

在一些實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和文獻(xiàn)中通常要使用雙筒解剖鏡、酒精燈、生理鹽水、固定液、HCl解離液、乙醇、背景凈化液、沖洗液等[1，3-6]。該方法不需要使用這些器具和藥品，在顯微鏡低倍鏡（4倍物鏡）下就可以分離唾腺組織和其他組織，因?yàn)椴襟E少、時(shí)間短，再加上1%醋酸洋紅具有一定的固定作用，唾腺細(xì)胞無細(xì)胞壁且間隙物質(zhì)少，所以可以省略以上器具和藥品。②剝離唾腺組織前先染色。

在以往的方法中，剝離唾腺組織一般要在生理鹽水中進(jìn)行，在鹽酸解離液中解離，或者在凈化液中處理以凈化背景，這些溶液對(duì)醋酸洋紅的染色有一定的影響，所以需要用水沖洗后才能加醋酸洋紅進(jìn)行染色[1，3-12]。此外，唾腺與食道管等組織顏色相近，很難辨別，解剖后如果沒有及時(shí)確認(rèn)，就會(huì)隨液體漂動(dòng)，而與其他組織混為一體，故常常容易誤將食道管等當(dāng)成唾腺，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。在剝離唾腺組織前，對(duì)果蠅3齡幼蟲頭部組織進(jìn)行染色，由于唾腺細(xì)胞體積大，唾腺染色體粗大，染色后很容易與其他組織部分區(qū)分開來，因此剝離出來的唾腺組織就比較干凈，背景干凈。由于操作過程中使用的試劑較少，醋酸洋紅染色受到的干擾就少，再加上在染液中剝離唾腺，又加快了醋酸洋紅的染色，所以染色時(shí)間就會(huì)縮短。

③實(shí)驗(yàn)材料的改進(jìn)。

以往的唾腺染色體制片和觀察實(shí)驗(yàn)中，選用的實(shí)驗(yàn)材料都是果蠅3齡幼蟲，但是果蠅3齡幼蟲比較小。選用日蠅作為實(shí)驗(yàn)材料，更容易制備出比較理想的裝片。

3.2 建議 ①拉出3齡幼蟲頭部時(shí)，解剖針不宜太尖太鋒利，可稍微傾斜解剖針，以免割破口器而使整個(gè)頭部縮進(jìn)幼蟲內(nèi)部，也可以用牙簽或大頭針代替。

②剝?nèi)⊥傧俳M織時(shí)，可將載玻片從顯微鏡載物臺(tái)上取下來，操作比較方便，但因?yàn)樵陲@微鏡看到的圖像與實(shí)際相反，即翻轉(zhuǎn)180°，所以將頭部各個(gè)組織分離開后，將載玻片置于顯微鏡下觀察唾腺組織，再去除其他組織部分。③敲打蓋玻片時(shí)用力要恰當(dāng)，以唾腺組織完全分散，呈淺紅霧狀為宜，避免因用力不足而導(dǎo)致細(xì)胞重疊從而影響觀察效果，或者因用力過大而導(dǎo)致唾腺染色體斷裂而漂走。

參考文獻(xiàn)

[1]劉祖洞，江紹慧.遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].2版.北京：高等教育出版社，1987：9-13.

[2] 楊大翔.“果蠅唾腺染色體的制備與觀察實(shí)驗(yàn)”的背景知識(shí)[J].生物學(xué)教學(xué)，2005，30（4）：37-39.

[3] 盧龍斗，常重杰，杜啟艷，等.遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，1996：27-30.

[4] 張志達(dá).如何做好“果蠅唾腺染色體觀察”實(shí)驗(yàn)[J].廊坊師專學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1997（3）：45-46.

[5] 龐瑞媛，謝文海，李桂芬.唾腺染色體實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)[J].玉林師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，23（3）：89-90.

[6] 薛小橋，曾慶韜，楊勇.一種易于掌握的果蠅唾腺染色體制片方法[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2000（5）：108-109，112.

[7] 胡甘.用于果蠅唾腺染色體實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)方法[J].實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)，2007（5）：38，52.

[8] 周志華.快速獲得果蠅唾腺體的技巧和方法[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2017，23（21）：39-40，63.

[9] 王曉杰，董梅，王永香，等.鹽酸解離對(duì)果蠅唾腺染色體解聚與制片效果的影響[J].青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，33（1）：24-26.

[10] 劉麗影，劉文靜，邵紅.果蠅唾腺染色體四種染色方法的比較[J].佳木斯大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，25（3）：424-426.

[11] 倪奎.三種染色法對(duì)果蠅唾腺染色體制片優(yōu)化設(shè)計(jì)[J].合肥學(xué)院學(xué)報(bào)（綜合版），2017，34（2）：79-83.

[12] 楊大祥，程劼，許也，等.果蠅（Drosophila melanogaster）唾腺染色體的制備及染色體識(shí)別[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014，19（1）：143-149.