雙酶法提取黑豆紅色素新工藝

褚盼盼等

摘 要：以黑豆皮為原料、黑豆紅色素提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)確定雙酶法提取黑豆紅色素的最佳工藝為酶用量（果膠酶+纖維素酶）（2+1） mg、酶解pH值3.6、酶解溫度55 ℃、料液比1∶25、酶解時(shí)間120 min、提取2次，提取率高達(dá)26.60%。研究結(jié)果顯示，采用雙酶法提取黑豆紅色素簡(jiǎn)單高效、提取條件溫和且無(wú)溶劑殘留問(wèn)題，適用于食品工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)。

關(guān)鍵詞：黑豆紅色素；提??；纖維素酶；果膠酶

中圖分類號(hào)：TS209 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.018

Abstract： Taking black soybean skin as the material， and black soybean red pigment extraction rate as index， on the basis of single factor experiment， through orthogonal test the double enzymatic extraction technology was determined. It was as follow enzyme dosage of black soybean red pigment （pectinase and cellulase） 2 mg +1 mg， enzyme solution pH 3.6， enzyme solution temperature of 55 ℃， material liquid ratio 1∶25， 120 min digestion time， extracting 2 times， extraction rate as high as 26.60%.The results showed that the double enzymatic extraction of black soybean red pigment is simple and efficient， has mild extraction conditions and no solvent residue problem， and is suitable to food industry large-scale production.

Key words： black soybean red pigment； extraction； cellulase； pectinase

黑豆紅色素，是一種常見(jiàn)的食品添加劑，其著色自然，同時(shí)具有一些生理功能如抗氧化、抗肥胖、延緩衰老、保護(hù)肝臟、降血脂[1]等。目前，黑豆紅色素的提取主要采取的是一些傳統(tǒng)的方法如溶劑提取法[2-8]、超聲波輔助提取法[9-10]、微波輔助提取法等[11]，色素提取率僅18%左右。提取的過(guò)程中不僅存在著提取時(shí)間長(zhǎng)、熱敏性組分易被破壞等問(wèn)題，而且還有生產(chǎn)的色素產(chǎn)品純度差、提取率低、存在異味和溶劑殘留等缺點(diǎn)[12]，嚴(yán)重制約了黑豆紅色素在食品工業(yè)的綜合利用。鑒于黑豆紅色素有著重要的藥理作用，近年來(lái)不少學(xué)者對(duì)黑豆紅色素的提取方法進(jìn)行了很多的研究探索，但主要還是集中在對(duì)傳統(tǒng)方法的優(yōu)化或改良上。

目前，利用酶法提取植物體內(nèi)活性成分已得到廣泛應(yīng)用。植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素和果膠，植物天然色素往往被包裹在其中而不易溶出。依據(jù)此原理，本研究采用纖維素酶和果膠酶兩種酶對(duì)黑豆皮進(jìn)行酶解，破壞其細(xì)胞壁骨架結(jié)構(gòu)使其逐級(jí)降解，促進(jìn)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)色素的溶出，增加黑豆紅色素的提取率[12]，從而實(shí)現(xiàn)食品工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)。目前，國(guó)內(nèi)利用酶法提取黑豆紅色素的研究報(bào)道尚少[13]，該研究有助于促進(jìn)該領(lǐng)域的研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

黑豆皮，市售。經(jīng)清洗、晾干、粉碎后過(guò)孔徑為0.25 mm篩制成黑豆皮粉，備用。

1.2 主要試劑與儀器

纖維素酶（2萬(wàn)U·g-1）：淮安市百麥綠色生物能源有限公司；果膠酶（10萬(wàn)U·g-1）：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。Neofuge 13R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；電動(dòng)攪拌機(jī)：杭州儀表電機(jī)廠；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 黑豆紅色素的提取工藝流程 黑豆皮粉→酶解提取→抽濾→合并各次濾液→50 ℃減壓濃縮→凍干→黑豆紅色素→計(jì)算紅色素提取率

紅色素提取率=（紅色素干質(zhì)量/黑豆皮干質(zhì)量）×100%

1.3.2 單因素試驗(yàn) 分別對(duì)影響黑豆紅色素提取效果的單因素如酶用量、酶解pH值、酶解溫度、料液比、酶解時(shí)間、提取次數(shù)等進(jìn)行研究。

1.3.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)較顯著的4個(gè)單因素分別選取3個(gè)最優(yōu)水平，依據(jù)L9（34）正交試驗(yàn)表篩選最優(yōu)組合以確定雙酶法提取黑豆紅色素的最佳工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶用量（果膠酶+纖維素酶）對(duì)黑豆紅色素提取率的影響 稱取1 g黑豆皮粉，在酶解pH值為4.6，酶解溫度為45 ℃、料液比1∶20、提取120 min條件下，分別對(duì)提取液的不同酶用量（果膠酶+纖維素酶）：1+0、0+1、0.5+0.5、0.5+1、1+0.5、1+1、1+2、1+3、1+4、2+1、2+2、2+3、2+4 mg進(jìn)行考察，提取1次，稱重后計(jì)算紅色素提取率。

由圖1可知，單獨(dú)使用果膠酶或纖維素酶的酶解效果均低于混合使用效果，在酶用量為果膠酶（mg）+纖維素酶（mg）為（2+1） mg時(shí)紅色素提取率最高。試驗(yàn)結(jié)果表明，在酶用量較高時(shí)，紅色素提取率均有不同程度的下降，原因可能是底物濃度不能對(duì)酶達(dá)到飽和，導(dǎo)致酶的作用受到抑制，導(dǎo)致色素提取率呈下降趨勢(shì)[14-16]。

2.1.2 酶解pH值對(duì)黑豆紅色素提取率的影響 稱取1 g黑豆皮粉，根據(jù)2.1.1結(jié)果，選擇紅色素提取率最高的酶用量，在酶解溫度為45 ℃、料液比1∶20、提取120 min條件下，分別對(duì)提取液pH 值分別為3.6、4、4.6、5、5.6、6的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液進(jìn)行考察，提取1次，稱質(zhì)量后計(jì)算紅色素提取率，結(jié)果如圖2。

2.1.3 酶解溫度對(duì)黑豆紅色素提取率的影響 稱取1 g黑豆皮粉，根據(jù)2.1.2結(jié)果，選擇紅色素提取率最高的酶用量、酶解pH值，在料液比1∶20、提取120 min條件下，分別對(duì)提取液的不同酶解溫度35、40、45、50、55、60 ℃進(jìn)行考察，提取1次，稱重后計(jì)算紅色素提取率。

由圖3可知，從35～55 ℃，隨著酶解溫度的提高，紅色素提取率隨之增加，繼續(xù)提高溫度，提取率隨之下降，說(shuō)明纖維素酶和果膠酶雙酶酶解提取黑豆紅色素最適溫度為55 ℃。

2.1.4 料液比對(duì)黑豆紅色素提取率的影響 稱取1 g黑豆皮粉，根據(jù)2.1.3結(jié)果，選擇紅色素提取率最高的酶用量、酶解pH值、酶解溫度，在提取120 min條件下，分別對(duì)提取液的不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40進(jìn)行考察，提取1次，稱重后計(jì)算紅色素提取率。

由圖4可知，料液比在1∶25時(shí)紅色素提取率為19.14%，達(dá)到最高。

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)黑豆紅色素提取率的影響 稱取1 g黑豆皮粉，根據(jù)2.1.4結(jié)果，選擇紅色素提取率最高的酶用量、酶解pH值、酶解溫度、料液比，分別對(duì)提取液的不同酶解時(shí)間60、90、120、150、180、210 min進(jìn)行考察，提取1次，稱質(zhì)量后計(jì)算紅色素提取率。

由圖5可知，從60～120 min，隨著酶解時(shí)間的增加，紅色素提取率隨之提高。如繼續(xù)增加酶解時(shí)間，提取率無(wú)明顯變化，所以確定黑豆紅色素最適酶解時(shí)間為120 min。

2.1.6 提取次數(shù)對(duì)黑豆紅色素提取率的影響 稱取1 g黑豆皮粉，根據(jù)2.1.5結(jié)果，選擇紅色素提取率最高的酶用量、酶解pH值、酶解溫度、料液比、酶解時(shí)間，分別對(duì)提取液的不同提取次數(shù)1、2、3次進(jìn)行考察，合并各次濾液，稱質(zhì)量后計(jì)算紅色素提取率。

由圖6可知，隨著提取次數(shù)的增加，紅色素提取率隨之提高。但第3次的提取率無(wú)明顯增加，從節(jié)約能源的角度考慮，確定黑豆紅色素最佳提取次數(shù)為2次。

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，黑豆紅色素最佳提取條件為：酶用量（果膠酶+纖維素酶） （2+1）mg、 酶解pH值4、酶解溫度55 ℃、料液比1∶25、酶解時(shí)間120 min、提取2次。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)較顯著的因素酶用量、酶解pH值、酶解溫度、料液比等4個(gè)因素分別選取3個(gè)最優(yōu)水平，依據(jù)L9（34）表安排正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1，得出黑豆紅色素最佳酶解提取條件。

由表2正交試驗(yàn)結(jié)果極差R值大小可知，4個(gè)因素對(duì)黑豆紅色素的提取率影響為：B（酶解pH值）>A（酶用量）>D（料液比）>C（酶解溫度）。最優(yōu)提取組合為A2B1C2D3，即酶用量（果膠酶+纖維素酶）（2+1） mg、酶解pH值3.6、酶解溫度55 ℃、料液比1∶25，提取率達(dá)26.60%。方差分析表明，以因素C為誤差項(xiàng)，因素A和B對(duì)黑豆紅色素提取率的影響差異顯著（P<0.05），因素C和D差異不顯著（P >0.05），與極差分析結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

以黑豆皮為原料，分別對(duì)影響黑豆紅色素提取率的單因素如酶用量、酶解pH值、酶解溫度、料液比、酶解時(shí)間、提取次數(shù)等進(jìn)行研究。在此基礎(chǔ)上，對(duì)較顯著的4個(gè)單因素分別選取3個(gè)最優(yōu)水平安排正交試驗(yàn)，確定雙酶法提取黑豆紅色素最佳條件：酶用量（果膠酶+纖維素酶）（2+1） mg、酶解pH值3.6、酶解溫度55 ℃、料液比1∶25、酶解時(shí)間120 min、提取2次，提取率高達(dá)26.60%。

在各種黑豆制品如豆油、豆乳、豆粉等的生產(chǎn)過(guò)程中，為改善產(chǎn)品風(fēng)味、防止非酶褐變，并賦予產(chǎn)品良好的色澤等，通常要將黑豆進(jìn)行脫皮等預(yù)處理工序，因此在豆制品的生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)得到大量的副產(chǎn)品，即黑豆皮。我國(guó)擁有豐富的黑豆資源，從黑豆制品加工的下腳料黑豆皮中提取天然色素，成本低廉、工藝簡(jiǎn)單且易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，因此具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用雙酶法提取黑豆紅色素簡(jiǎn)單高效、提取條件溫和且無(wú)溶劑殘留問(wèn)題，適用于食品工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)。

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