青楊天牛觸角味覺受體基因的鑒定

王佳同 張健 程彬 王寅亮 陳琪 任炳忠

摘要 [目的] 鑒定青楊天牛（Saperda populnea）觸角味覺受體基因的種類。[方法] 根據(jù)青楊天牛觸角總RNA的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法對(duì)其味覺基因進(jìn)行鑒定，并采用RT-PCR技術(shù)測(cè)定味覺受體基因在不同組織中的表達(dá)量。[結(jié)果] 共鑒定出青楊天牛味覺受體基因11種，其中4種全長(zhǎng)味覺受體基因（SpopGR1、SpopGR3、SpopGR4、SpopGR5）在青楊天牛雌雄觸角均有表達(dá)，除SpopGR5，另外3個(gè)基因均在足表達(dá)，SpopGR1和SpopGR4在雌觸角、雄觸角、頭、胸、腹、足和翅這7個(gè)部位均有表達(dá)，但表達(dá)量偏低。[結(jié)論] 通過與果蠅味覺受體基因建樹分析，推測(cè)SpopGR7、SpopGR9、SpopGR10可能屬于苦味受體家族，行使對(duì)苦味的感知功能。該研究有助于在分子水平上加深對(duì)昆蟲味覺感知系統(tǒng)的理解，為以后采用化學(xué)生態(tài)手段對(duì)青楊天牛進(jìn)行調(diào)控提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 青楊天牛；味覺受體；序列分析

中圖分類號(hào) S763.38 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）13-0111-03

Identification of Saperda populnea Antennal Gustatory Receptor Gene

WANG Jiatong1， ZHANG Jian2， CHENG Bin2 et al

（1.School of Life Sciences， Northeast Normal University， Changchun，Jilin 130024；2.Jilin City Academy of Forestry， Changchun， Jilin 130033）

Abstract [Objective]To identify the types of gustatory receptor genes of Saperda populnea. [Method]To identify the types of gustatory receptor genes based on the transcriptomes information of total RNA of antennae of S. populnea connected with bioinformatics analysis method. Expressions of gustatory receptors of S. populnea were measured with RT-PCR technique. [Result] 11 types of gustatory receptor genes of S. populnea were identified. The result showed that four complete length of gustatory receptor genes （SpopGR1， SpopGR3， SpopGR4 and SpopGR5） were all expressed in antennae and three genes were expressed in leg except SpopGR5. SpopGR1 and SpopGR4 were lowly expressed in female antennae， male antennae， head，chest， abdomen， leg and wing. [Conclusion] Phylogenetic analysis of gustatory receptor genes indicated that SpopGR7， SpopGR9， SpopGR10 may perform the function of bitter taste. This research can promote the understanding of insect gustatory system and establishes a foundation for controlling of S. populnea by chemical ecology measures.

Key words Saperda populnea；Gustatory receptors；Sequence analysis

昆蟲具有專一的化學(xué)感受系統(tǒng)，能夠感知環(huán)境的各種刺激從而指導(dǎo)它們的行為，通過化學(xué)線索，昆蟲可以定位食物、尋找配偶、躲避捕食者和毒素、與同伴交流等[1-2]。多種嗅覺蛋白參與昆蟲將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)的這一過程中，其中嗅覺受體（olfactory receptor，OR）和味覺受體（gustatory receptor，GR）發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3-5]。雖然味覺受體在感受化學(xué)刺激和調(diào)節(jié)昆蟲行為等方面發(fā)揮著重要作用，但截至目前對(duì)味覺感受分子機(jī)制的研究相對(duì)較少。昆蟲的味覺感器（gustatory sensillum）主要分布在觸角、下唇須、下顎須、舌、咽、內(nèi)唇、足的跗節(jié)和產(chǎn)卵器等部位，味覺感器內(nèi)分布著大量味覺神經(jīng)軸突，這些軸突具有感受不同化學(xué)信號(hào)刺激的功能，當(dāng)昆蟲的味覺感器感受到外界的刺激物質(zhì)后，味覺感器內(nèi)的味覺受體可以將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，通過神經(jīng)軸突傳送到昆蟲腦的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS），中樞神經(jīng)系統(tǒng)輸出調(diào)控行為的指令，使昆蟲產(chǎn)生各種相應(yīng)的行為反應(yīng)[6-8]。

青楊天牛（Saperda populnea）是我國(guó)北方地區(qū)楊樹人工林的重要鉆蛀性害蟲，主要為害銀白楊、毛白楊、加楊等楊樹品種。其幼蟲蛀食枝干形成紡錘狀蟲癭，阻礙養(yǎng)分的正常運(yùn)輸使枝梢干枯，影響成材；如果幼樹的干髓處被為害，整株樹都會(huì)死亡[9]。筆者通過對(duì)青楊天牛的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，共鑒定出11種味覺受體基因，從分子水平上填補(bǔ)了青楊天牛味覺受體研究的不足，以期為以后采用化學(xué)生態(tài)手段調(diào)控青楊天牛的實(shí)踐提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

于2016年4—6月分別在吉林省西部地區(qū)松原市乾安縣和白城市鎮(zhèn)賚縣的楊樹被害林中剪取60～80 cm 的天牛蟲癭帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，外部罩上60目的紗網(wǎng)，置于室內(nèi)封閉保存，待成蟲羽化后采集備用。

1.2 青楊天牛觸角RNA的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

試驗(yàn)試劑與儀器：DEPC水、Trizol、三氯甲烷、異丙醇、乙醇、無(wú)核酸酶水、離心柱（QiagenQIAshredder）、尖嘴鑷、眼科剪、離心管、研磨棒、移液槍用槍頭、移液槍、離心管架、NanoDrop分光光度計(jì)、臺(tái)式高速冷凍微量離心機(jī)（廣州利橋儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

RNA提取與檢驗(yàn)：取經(jīng)-20 ℃冰凍10 min的青楊天牛觸角12只（雌雄成蟲各3頭），用DEPC處理過的眼科剪及尖嘴鑷仔細(xì)地從觸角基部將觸角分離，將取下的觸角放入裝有900 μL Trizol的1.5 mL離心管中，進(jìn)行反復(fù)研磨?？俁NA提取按照試劑盒（Qiagen）說(shuō)明進(jìn)行。使用NanoDrop分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度并膠檢確認(rèn)，寄送樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 味覺受體基因的鑒定

前人研究結(jié)果表明，昆蟲的味覺受體各基因家族之間的氨基酸序列同源性僅為8%～12%，且在生物體各組織部位內(nèi)的表達(dá)量極低，給昆蟲味覺受體基因的鑒定帶來(lái)了較大的困難[10]。目前，較為公認(rèn)的昆蟲味覺受體基因的鑒定方法主要是通過判別基因的C-末端是否具有motif保守序列及7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的特征來(lái)進(jìn)行鑒定。

該研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)方法，從青楊天牛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果中篩選到味覺受體基因，通過在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)一步進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)，對(duì)編碼氨基酸序列的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)并判斷昆蟲味覺受體基因C-末端是否具有1個(gè)保守序列等方法，最終鑒定味覺受體基因。

1.4 味覺受體基因在各組織中的表達(dá)分析

試驗(yàn)試劑與儀器：移液槍、移液槍用槍頭、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransGen Biotech）、無(wú)核酸酶水、PCRmix。

分別提取青楊天牛成蟲雄性觸角、雌性觸角、頭、胸、腹、足以及翅的總RNA 并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA鏈。采用RT-PCR方法：每個(gè)反應(yīng)以不同組織的200 ng cDNA為模板。反應(yīng)條件為94 ℃ 90 s；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，33個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸7 min。將產(chǎn)物上電泳槽并檢膠，與Marker比較對(duì)照大小。

1.5 味覺受體SpopGRs系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

為確定SpopGRs與其他類群昆蟲味覺受體GRs之間的進(jìn)化關(guān)系，選取鞘翅目昆蟲中已經(jīng)鑒定出的幾種昆蟲味覺受體家族的核苷酸序列與在青楊天牛中篩選到味覺受體基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，選取序列包括赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、中歐山松大小蠹（Dendroctonus ponderosae）、云杉八齒小蠹（Ips typographus）、銅綠麗金龜（Anomala corpulenta）、榆黃葉甲（Pyrrhalta maculicollis）、榆藍(lán)葉甲（Pyrrhalta aenescens）在內(nèi)共6種昆蟲的味覺受體基因總計(jì)162條序列，并對(duì)SpopGRs分別進(jìn)行命名。再將11種SpopGRs與黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的68個(gè)味覺受體基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，對(duì)SpopGRs基因的功能表達(dá)進(jìn)行分析。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建均采用MEGA 6.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 青楊天牛觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

經(jīng)組裝后共得到122 579條Transcript和87 984條Unigene，Transcript與Unigene的N50分別為1 123和575，組裝完整性較高。組裝結(jié)果見表1。

2.2 青楊天牛味覺受體基因的鑒定及序列分析 利用已有的青楊天牛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得 11個(gè)青楊天牛味覺受體基因核苷酸序列（表2）。

2.3 味覺受體表達(dá)量分析

利用RT-PCR獲得了成蟲不同組織（包括雄觸角、雌觸角、頭、胸、腹、足、翅）4種全長(zhǎng)味覺受體的特異性表達(dá)情況。4種基因在青楊天牛雌雄觸角均有表達(dá)，除SpopGR5，另外3個(gè)基因均在足部表達(dá)，SpopGR1和SpopGR4在這7個(gè)部位均有表達(dá)，但表達(dá)量偏低（圖1）。

2.4 味覺受體SpopGRs系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的青楊天牛味覺基因序列與已知的6種鞘翅目昆蟲味覺受體基因序列通過 BLAST 程序進(jìn)行同源性比對(duì)，共獲得11個(gè)青楊天牛味覺受體基因核苷酸序列。由系統(tǒng)發(fā)育樹可以得出11個(gè)SpopGRs與其他類群昆蟲間的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SpopGRs與赤擬谷盜的TcasGRs具有很高的同源性（圖2）。根據(jù)與赤擬谷盜的同源性，將青楊天牛味覺基因命名為SpopGR1～SpopGR11。

3 結(jié)論與討論

筆者從青楊天牛觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共鑒定出11個(gè)味覺受體基因，此外，可能還有一些沒能鑒定到的味覺受體基因存在，主要原因在于味覺受體基因在味覺器官的表達(dá)水平過低[12]。通過RT-PCR對(duì)4個(gè)全長(zhǎng)的味覺受體基因進(jìn)行組織表達(dá)情況的鑒定，味覺受體基因均在觸角中表達(dá)，說(shuō)明青楊天牛的觸角可能是其探測(cè)味覺的重要器官。

在果蠅體內(nèi)已經(jīng)鑒定出54個(gè)味覺受體，主要參與編碼苦味、甜味及二氧化碳受體蛋白。其中DmelGR64和DmelGR5a編碼甜味受體蛋白，用于檢測(cè)葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽糖醇、水蘇糖以及棉子糖等[11，13-14]。DmelGR32a、DmelGR33a和DmelGR66a參與編碼苦味受體蛋白，用于檢測(cè)奎寧、洛貝林和咖啡因等。通過系統(tǒng)發(fā)育樹可知SpopGR7與苦味受體的DmelGR32a聚在一起，SpopGR9與SpopGR10同源，與編碼苦味受體的DmelGR33a聚在一起，推測(cè)SpopGR7、SpopGR9和SpopGR10都屬于苦味受體家族的成員，參與行使苦味感知功能。

昆蟲的味覺在指導(dǎo)昆蟲活動(dòng)中起到重要作用，但人們對(duì)味覺的研究重點(diǎn)依然只停留在已獲得基因組的昆蟲上。青楊天牛是一種重要的林業(yè)害蟲，通過深入了解其味覺受體基因的功能，為以后采用高效、低毒、無(wú)公害的化學(xué)生態(tài)調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

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