人參CYP716A53v2基因的克隆與序列分析

張濤++韓梅++劉翠晶

摘要：研究人參皂苷生物合成途徑中的影響因子。以五年生人參根組織為試驗(yàn)材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1條鏈，利用PCR法對(duì)人參中的原人參三醇合成酶（CYP716A53v2）基因的cDNA進(jìn)行克隆及序列分析。獲得CYP716A53v2基因全長(zhǎng)片段為1 506 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 410 bp，編碼470個(gè)氨基酸多肽。生物信息學(xué)分析顯示，CYP716A53v2基因編碼蛋白質(zhì)不含跨膜區(qū)域。 說(shuō)明CYP716A53v2基因與其他植物氨基酸序列具有較高同源性，其中與人參、西洋參、三七同源性分別為99%、98%、98%。

關(guān)鍵詞：人參皂苷；基因克??；序列分析

中圖分類號(hào)： S567.5+10.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0053-04

收稿日期：2015-05-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31270371）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2011BAI03B01-02）。

作者簡(jiǎn)介：張濤（1991—），男，碩士研究生，主要從事藥用植物分子生態(tài)學(xué)。E-mail：251073371@qq.com。

通信作者：韓梅，教授，主要從事藥用植物資源與藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)。E-mail：hanmei77@sohu.com。人參（Panax ginseng C.A.Meyer）為五加科人參屬名貴藥材，自古以來(lái)是中國(guó)重要藥用植物，有“百草之王”的美譽(yù)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參皂苷為人參主要藥效成分，按苷元基本骨架可分為齊墩果烷型和達(dá)瑪烷型，屬于三萜類化合物。目前，已從人參中分離得到約 90 種人參皂苷單體[1-3]?？拱┗钚猿煞秩藚⒃碥誖g3已經(jīng)于2000年批準(zhǔn)為一類新藥[4]；隨著老齡化人口增加和疾病的改變，如心血管疾病和腫瘤人口的增加，人參皂苷Rg和Re被命名為血管生長(zhǎng)因子。人參皂苷含量和組成是人參質(zhì)量的重要指標(biāo)，人參皂苷的含量較低，人工合成次生代謝產(chǎn)物人參皂苷尚未實(shí)現(xiàn)，對(duì)于一些含量甚微的單體皂苷的新藥開(kāi)發(fā)還較為困難。人參皂苷的生物合成途徑與功能基因的表達(dá)量之間的關(guān)系仍處于探究階段。深入了解人參皂苷生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)理，在分子水平上實(shí)現(xiàn)人參皂苷的人工合成，這將是利用生物技術(shù)手段大量生產(chǎn)人參皂苷的必然前提。

原人參三醇合成酶（CYP716A53v2）是達(dá)瑪烷型人參皂苷合成的重要調(diào)控酶，原人參三醇合成酶催化原人參二醇到原人參三醇的過(guò)程，相關(guān)試驗(yàn)研究認(rèn)為，細(xì)胞色素P450 CYP716A53v2基因mRNA表達(dá)量與三萜皂苷的生成量呈正相關(guān)[5]。本試驗(yàn)對(duì)人參皂苷生物合成途徑中的細(xì)胞色素P450 CYP716A53基因進(jìn)行了克隆與序列分析，目的在于從基因水平研究人參皂苷生物合成途徑的調(diào)控機(jī)制，實(shí)現(xiàn)三萜皂苷基因的高效表達(dá)，增加人參藥材的藥效成分含量，提高人參藥材質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為實(shí)現(xiàn)未來(lái)藥材質(zhì)量安全、可控、穩(wěn)定、有效的發(fā)展目標(biāo)提供理論依據(jù)。1材料與方法

1.1材料

五年生鮮人參取自吉林省撫松縣撫南林場(chǎng)，位于 42°03′06″N、127°33′21″E，海拔903 m，用刀將根部切成小塊放入凍存管迅速用液氮冷凍于-80 ℃保存待用，試驗(yàn)所用部位為人參根組織。

1.2主要試劑和儀器

植物總RNA提取試劑盒，2×Power Taq PCR Mastermix，凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，DNA 連接試劑盒等均購(gòu)自北京百泰克生物科技有限公司；PrimeScript Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，LB 培養(yǎng)基，JM109 感受態(tài)菌株均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。Eppendorf Mastercycler nexus PCR儀，德國(guó)；DYY-8C瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一；GIS-2010凝膠成像系統(tǒng)，上海Tanon；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)，MDF-382E超低溫冰箱，日本SANYO等。

1.3方法

1.3.1人參根部組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄成cDNA的第1條鏈按照植物總RNA提取試劑盒的提取步驟對(duì)人參根組織總RNA進(jìn)行提取，RNA質(zhì)量的檢測(cè)用1%瓊脂糖凝膠電泳。以提取的總RNA為模板，以 Oligo-dT 為引物，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存。

1.3.2PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank上已報(bào)道的人參細(xì)胞色素P450 CYP716A53v2基因cDNA（登錄號(hào)為JX036031）序列設(shè)計(jì)引物，上游引物為53F：5′-GGGCAAAATCACAGAATTCTTG，下游引物為53R：5′-TTAAAGCGTACAAGGTGATAGACG。以五年生人參根cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：去離子水7.4 μL，2倍 Power Taq PCR Mastermix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1% 瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)。

1.3.3細(xì)胞色素P450 CYP716A53基因的克隆與序列分析PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，放入紫外分析儀內(nèi)切下目的片段，用凝膠回收試劑盒純化回收，再將純化回收目的片段與pMD20-T載體連接成重組質(zhì)粒pMD20-T/CYP716A53v2，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆，涂布在X-gal、IPTG和 Amp 的LB平板上，在氣候箱中37 ℃培養(yǎng)14～16 h，隨機(jī)挑取10個(gè)白色菌落，搖菌培養(yǎng)12～14 h，通過(guò)質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒和菌落PCR進(jìn)行快速鑒定，將陽(yáng)性克隆菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序鑒定。將測(cè)序獲得的序列用DNAMAN 6.0整理翻譯成氨基酸，通過(guò)ExPasy ProtParam （http：//www.expasy.org/tools/protparam/.html） 分析推測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；采用TMHMM 2.0 進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；利用Blast搜索NCBI上的核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)和氨基酸數(shù)據(jù)庫(kù)中近緣物種的CYP序列信息，通過(guò)MEGA 5.0構(gòu)建Neighbor-Joining 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000。

2結(jié)果與分析

2.1人參總RNA質(zhì)量檢測(cè)

本試驗(yàn)采用試劑盒法將提取的人參總RNA經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，所提取的總RNA呈現(xiàn)出28S rRNA和18S rRNA等2條條帶，條帶清晰完整，沒(méi)有明顯降解，說(shuō)明總RNA 提取成功。

2.2人參細(xì)胞色素P450 CYP716A53v2基因PCR結(jié)果

以人參根組織cDNA為模板，用細(xì)胞色素P450 CYP716A53v2基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得片段大小為1 506 bp（圖2）。

2.3細(xì)胞色素P450 CYP716A53v2基因的克隆與序列分析

使用載體通用引物對(duì)陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，獲得大小約1 506 bp 片段（圖3）。提取的質(zhì)粒電泳結(jié)果顯示（圖4），質(zhì)粒分子量較大，說(shuō)明 pMD20-T載體有外源基因片段插入，為陽(yáng)性克隆。

對(duì)陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)行測(cè)序，并利用 DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接，得到1 506 bp 堿基序列，翻譯起始位點(diǎn)位于16 bp，PolyA 位于1 423 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 410 bp，共編碼470個(gè)氨基酸，與GenBank上發(fā)布的人參細(xì)胞色素P450 CYP716A53v2基因的氨基酸（登錄號(hào)為AFO63031 ）序列完全相符，表明所得重組子是正確的（圖5）。

利用ExPasy ProtParam（http：∥www.expasy.org/tools/protparam/.html）在線工具分析人參P450 CYP716A53v2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)。推測(cè)其蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為53.297，分子式為C2 458H3 793N619O665S20，總原子數(shù)為7 555。理論等電點(diǎn)為9.12，帶正電殘基（精氨酸+賴氨酸）為56，帶負(fù)電殘基（天冬氨酸+谷氨酸）為46。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為38.57，表明人參P450 CYP716A53v2基因編碼的蛋白不穩(wěn)定。脂肪系數(shù)為85.82，親水性系數(shù)為-0.081，表明其為親水蛋白。利用 TMHMM2.0 進(jìn)行蛋白跨膜分析，人參P450 CYP716A53v2基因編碼的蛋白質(zhì)沒(méi)有跨膜區(qū)域 （圖6）。

人參CYP基因與其他植物CYP基因具有較高的親源性，分別達(dá)到人參（AFO36031）99%、西洋參（AGC31652）98%、三七（AHK23636）98%、西洋參（AED99872）97%、刺五加（AHA50080）84%。人參CYP基因與其他植物相關(guān)基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖7。人參CYP基因與五加科植物三七（AHK23636）、人參（AF036031）、西洋參（AGC31652） 、刺五加（AHA50080）以及西洋參（AED99872）親緣性較高，與植物種屬之間的進(jìn)化相符。

3結(jié)論與討論

人參皂苷的成分及總皂苷的含量是評(píng)價(jià)人參藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)，三萜皂苷作為人參藥材的次生代謝產(chǎn)物，其中，Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1等是主要成分，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、保肝護(hù)肝等功效[6-8]，尤其是Rg1對(duì)心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)起到一定的調(diào)節(jié)作用，還具有抑制細(xì)胞凋亡、擴(kuò)張血管、抗衰老，運(yùn)動(dòng)疲勞的恢復(fù)等作用[9]。目前，有關(guān)人參皂苷積累和形成規(guī)律的研究尚不充分，制約了人參藥材質(zhì)量調(diào)控機(jī)制的研究，已成為進(jìn)一步提升人參藥材質(zhì)量的制約因素[10]。

人參細(xì)胞色素P450 CYP716A53v2催化原人參二醇到原人參三醇，四環(huán)三萜皂苷從達(dá)瑪烷二醇羥基化之后是由CYP（P450）和糖基轉(zhuǎn)移酶的糖基化進(jìn)行合成的，原人參二醇合成酶（CYP716A47）催化達(dá)瑪烷二醇C-12位置羥基化，得到原人參二醇，原人參三醇合成酶（CYP716A53v2）催化原人參二醇得到原人參三醇[4]，再經(jīng)由糖基化得到單體皂苷Rg1。本

試驗(yàn)所克隆的人參細(xì)胞色素P450 CYP716A53v2基因與三七、西洋參、刺五加等植物細(xì)胞色素CYP（P450）基因序列同源性都很高，它們均屬于植物三萜類化合物積累和形成的重要調(diào)控限速酶——細(xì)胞色素氧化酶家族，同時(shí)該試驗(yàn)也驗(yàn)證了種屬親緣關(guān)系越近，代謝產(chǎn)物越趨同的觀點(diǎn)。筆者認(rèn)為，可以從人參屬其他植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物中尋找人參皂苷的替代產(chǎn)物。Han等對(duì)CYP716A的2個(gè)亞族基因（CYP716A52v2和CYP716A53v2）進(jìn)行了判定，經(jīng)過(guò)過(guò)茉莉酸甲酯的處理，重組WAT21酵母的異位表達(dá)轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，體外酶活性測(cè)定以及液體色譜和大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜的確定[4-5]，結(jié)果表明，CYP716A53v2基因的產(chǎn)物是原人參二醇6羥化酶，它是達(dá)瑪烷型三萜苷元在人參皂苷生物合成中的重要步驟，而CYP716A52v2基因的產(chǎn)物是β-香樹(shù)素C28位羥基化酶，其催化β-香樹(shù)素生成齊墩果酸，再經(jīng)由糖基化生成單體皂苷Ro。因此，人參細(xì)胞色素P450 CYP716A53v2基因在一定程度上可以決定人參皂苷生物合成的方向，可以在分子水平上用于調(diào)節(jié)人參皂苷的生物合成，對(duì)于進(jìn)一步提高人參藥材質(zhì)量具有重要指導(dǎo)意義。

通常情況下次生代謝產(chǎn)物是藥用植物的主要藥效成分，是藥材質(zhì)量的重要標(biāo)志[11]，即含量及藥效成分是藥用植物的表現(xiàn)型，表現(xiàn)型是由基因型和環(huán)境條件共同作用的[12]。所以，清晰地認(rèn)識(shí)以次生代謝產(chǎn)物為主體的藥效成分的形成積累規(guī)律及其生態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制，是實(shí)現(xiàn)藥材質(zhì)量控制的重要前提，也是目前藥材質(zhì)量控制技術(shù)研究的瓶頸[13-14]。從生態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)角度，開(kāi)展人參皂苷形成與積累規(guī)律的研究，闡明其影響主導(dǎo)生態(tài)因子和調(diào)控機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)人參藥材質(zhì)量調(diào)控具有重要指導(dǎo)意義，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)人參藥材質(zhì)量“安全、穩(wěn)定、可控、有效”的目標(biāo)。

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