黃粉甲翅芽生長因子基因的克隆及表達分析

趙滿+李麗芳+王友竹+Elena+N.+Elpidina+朱家穎

摘要：翅芽生長因子（imaginal disc growth factor，IDGF）是一類調(diào)節(jié)昆蟲發(fā)育和生長的因子。利用RACE克隆技術，克隆獲得黃粉甲（Tenebrio molitor） IDGF基因，其cDNA序列長1 465 bp，開放閱讀框為1 296 bp，可編碼431個氨基酸，預測理論分子量為48.25 ku，等電點為7.63。氨基酸序列同源比對分析發(fā)現(xiàn)，黃粉甲IDGF與赤擬谷盜（Tribolium castaneum）和蔗根非耳象（Diaprepes abbreviatus）的IDGF相似性分別為89%、71%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，黃粉甲IDGF與赤擬谷盜IDGF進化關系最近。熒光定量PCR分析表明，在不同發(fā)育階段，IDGF基因在幼蟲1齡和2齡中的表達量明顯高于其他發(fā)育階段。在蛹期不同組織中，IDGF基因在脂肪體中的表達量最高。被管氏腫腿蜂（Scleroderma guani）寄生后，IDGF基因的轉(zhuǎn)錄水平未受影響，表明寄生不能調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄表達。

關鍵詞：翅芽生長因子；基因克隆；黃粉甲；序列分析；管氏腫腿蜂

中圖分類號： S433.5

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0095-04

翅芽生長因子（imaginal disc growth factor，IDGF）是一種可溶性多肽生長因子，因在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）翅芽C1.8+細胞中鑒定具有促進翅芽細胞的增殖和生長而得名[1-2]。最初，科學家們在黑腹果蠅中通過同源性搜索和遺傳分析發(fā)現(xiàn)存在一些類生長因子，如Spitz和Gurken的表皮生長因子（EGF）、纖維細胞生長因子（FGF）及轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）[2-6]。但是，這些基因不具有生長因子所具備的促進有絲分裂活性，而僅是這些基因編碼的分泌蛋白異常表達能導致細胞增生并抑制生長[7-9]。然而，經(jīng)細胞體外培養(yǎng)認為，IDGF可能是作為胰島素或類胰島素的一個輔助因子而發(fā)揮生理功能[10-11]。目前，遺傳學研究發(fā)現(xiàn)，IDGF參與調(diào)節(jié)果蠅的生長發(fā)育，在果蠅的胚胎卵黃細胞、胚胎和幼蟲的脂肪體中顯著表達，其蛋白分泌到血淋巴并運輸?shù)桨袠私M織而發(fā)揮生理功能[2]。本研究從黃粉甲（Tenebrio molitor）蛹中克隆得到IDGF基因的cDNA序列，并采用熒光定量PCR方法研究該基因在黃粉甲不同發(fā)育階段、不同組織以及被管氏腫腿蜂（Scleroderma guani）寄生后的表達情況，為今后深入研究該基因的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

供試昆蟲參照Zhu等的方法[12]進行飼養(yǎng)。黃粉甲幼蟲用飼料和潔凈白菜葉室溫自然光條件飼養(yǎng)。利用黃粉甲蛹在人工氣候箱[（25 ± 1） ℃，相對濕度75%]中繁育管氏腫腿蜂。管氏腫腿蜂成蜂用蘸透20%蜂蜜水的脫脂棉球提供營養(yǎng)。

1.2 IDGF的克隆及分析

利用Trizol試劑法（Invitrogen）提取黃粉甲蛹總RNA。采用分光光度法測定總RNA含量，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量。以提取的總RNA為模板，用SMARTM RACE cDNA amplification kit （Clontech）合成cDNA模板。依據(jù)實驗室前期對黃粉甲cDNA文庫測序獲得IDGF片段序列，用Primer Premier 5.0設計5′ RACE（5′-CGAACGCCAGACGATGTTCGACAGAT-3′）和3′RACE（5′-CGCACCCAACAACAAG CTGAT-3′）特異性引物。參照RACE試劑盒說明書，PCR擴增獲得IDGF基因的3′端和5′端序列。PCR反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切取目的條帶并純化后送至上海杰李生物技術有限公司測序。

利用Genetyx軟件將翅芽生長因子IDGF基因的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，利用SignalP 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽預測，結構域采用MotifScan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）進行預測，利用ClustalX 1.83和MEGA 5.0軟件進行多序列比對和構建分子系統(tǒng)進化樹[13-14]。

1.3 熒光定量PCR

參照Zhu等的方法[15]收集黃粉甲不同發(fā)育階段（幼蟲1～3齡、蛹、成蟲）、蛹不同組織（表皮、脂肪體、血細胞）及被管氏腫腿蜂寄生和未寄生（6、12、24、48 h）蛹樣品進行總RNA提取，提取的總RNA使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板。根據(jù)本次克隆獲得的黃粉甲IDGF cDNA序列，設計熒光定量正向引物（5′-CCCAACGTTAACAGCTCT-3′）和反向引物（5′-CCTGTCGATTAATTCGTA-3′），以18 S RNA基因（5′-TTTCAAATGTCTGCCTTATC-3′和5′-TGTGGTAGCCGTTTCTCA-3′）作為內(nèi)參使用Rotor Gene-Q熒光定量PCR儀檢測IDGF基因在黃粉甲不同發(fā)育階段、不同組織以及寄生與未寄生后的表達情況，每個處理重復3次。PCR反應條件為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，40個循環(huán)。熒光定量PCR結果采用2-ΔΔCT法[16]，數(shù)據(jù)顯著性差異分析采用SPSS軟件進行分析[17]。

2 結果與分析

2.1 IDGF基因的克隆及序列分析

克隆獲得的黃粉甲IDGF基因cDNA長為1 465 bp，開放閱讀框框長為1 296 bp，該基因可編碼431個氨基酸，5′端非編碼區(qū)50 bp，3′端非編碼區(qū)119 bp（圖1）。其推導的氨基酸序列預測理論分子量為48.25 ku，等電點為7.63。SignalP分析發(fā)現(xiàn)，該IDGF基因推導的氨基酸序列中存在信號肽序列（MKILICALLALAAYVAA）。氨基酸序列同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，黃粉甲IDGF與赤擬谷盜（Tribolium castaneum）IDGF的相似性為89%，與蔗根非耳象（Diaprepes abbreviatus）IDGF的相似性為71%（圖2）。MotifScan分析發(fā)現(xiàn)，該IDGF基因cDNA序列中存在1個N-糖基化位點（NSSV216-219），1個依賴cGMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點（RKGT360-363），5個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（TILE116-119、SVVD176-179、SKEE322-325、SYPE329-332、TLDD408-411），6個N-豆蔻酰化位點（GLDLAW142-147、GLLLTL204-209、GAPNNK279-284、GIWVGY376-381、GNKASY388-393、GLCTGD414-419），5個蛋白激酶C磷酸化位點（SDK18-20、SYK64-66、TFR199-201、TPK242-244、SKR358-360），2個酪氨酸激酶磷酸化位點（RNPKEADY245-252、RKFDENADY262-270），第119位點至第137位點是一個未知蛋白功能結構域，第19位點至第410位點氨基酸區(qū)域是18糖基水解酶家族的保守結構域。利用MEGA 5.0構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示黃粉甲IDGF與赤擬谷盜IDGF聚在一起，進化關系最近（圖3）。

2.2 IDGF基因的表達特征

在不同發(fā)育階段，IDGF基因在幼蟲1齡和2齡中的表達量明顯高于其他發(fā)育階段，成蟲次之，蛹期表達量最低（圖4）。在蛹期不同組織中，IDGF基因在脂肪體中的表達量最高，血細胞次之，而表皮中幾乎沒有表達（圖5）。被管氏腫腿蜂寄生后，IDGF基因的表達不會發(fā)生顯著變化，表明寄生未對該基因的表達產(chǎn)生調(diào)控作用（圖6）。

3 結論與討論

通過RACE技術克隆獲得的IDGF基因推導的氨基酸序列預測分子量為48.25 ku，與先前報道的黑腹果蠅IDGF家族基因約為50 ku和菜粉蝶（Pieris rapae）IDGF為52 ku大小相近[1，18]。Varela等在果蠅IDGF-2基因研究中發(fā)現(xiàn)其含有18糖基水解酶家族，黃粉甲IDGF基因氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)也存在18糖基水解酶家族保守結構域[11]。

在果蠅IDGF研究中發(fā)現(xiàn)，IDGF在果蠅胚胎卵黃細胞、胚胎和幼蟲中均有表達，但在幼蟲期表達顯著[1-2]。通過對意大利蜜蜂（Apis mellifera）工蜂幼蟲不同日齡IDGF基因的表達特征研究表明，該基因在幼蟲期表達顯著[19]。與這些研究結果相似，黃粉甲IDGF在幼蟲1齡和2齡的表達量顯著高于蛹和成蟲階段。在果蠅幼蟲中，IDGF基因在脂肪體中的顯著表達[2，20]。在菜粉蝶中，IDGF在脂肪體和血細胞中均有表達，但脂肪體中的表達量明顯高于血細胞中的表達量[10，21]。同樣，黃粉甲IDGF基因在脂肪體中顯著表達，且明顯高于血細胞中的表達量。管氏腫腿蜂寄生黃粉甲蛹后，IDGF基因不受寄生所調(diào)控，這與Asgari等報道的菜粉蝶被微紅盤絨繭蜂寄生和注射多份DNA病毒后IDGF基因的表達沒有受到影響[18]以及Zhu等所報道的菜粉蝶被蝶蛹金小蜂寄生后IDGF轉(zhuǎn)錄水平不受影響[21]的結果相似。本研究結果表明，黃粉甲IDGF基因應不受寄生蜂所攜帶的寄生因子所調(diào)控。

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