高效液相色譜法測定黃瓜中三羥基克百威的不確定度評定

田甜 張瑜

[摘要]對高效液相色譜法測定黃瓜中三羥基克百威含量的不確定度進行評估，并分析產(chǎn)生該方法不確定度的來源。經(jīng)檢測黃瓜中的三羥基克百威含量為0.08305mg/kg時，其擴展不確定度為0.00276 mg/kg，k=2（95%置信度）。評定結果表明，標準峰面積的測定（）是影響該方法不確定度的主要因素。

[關鍵詞]高效液相色譜法；不確定度；黃瓜；三羥基克百威

[中圖分類號]S481.8 [文獻標識碼]A

克百威是廣譜、高效、高毒性的氨基甲酸酯類殺蟲、殺螨、殺線蟲劑，可以被植物吸收并輸送到莖葉部，達到防治害蟲的目的。三羥基克百威是克百威的主要代謝產(chǎn)物，具有觸殺和胃毒作用，屬于丁硫克百威的毒代謝產(chǎn)物，若與膽酰脂酶結合具有不可逆性，因此毒性甚高。根據(jù)國家標準《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量，GB 2763-2016》，蔬菜中三羥基克百威農(nóng)藥殘留按照 NY/T761-2008規(guī)定的方法進行檢測。為有效控制黃瓜中使用該農(nóng)藥所帶來的殘留風險，實驗人員根據(jù)該方法對黃瓜中三羥基克百威的殘留量進行有效監(jiān)測。

為了進一步提升檢測分析方法的有效性及可靠性，對其進行不確定度的評估顯得格外有意義。本研究依據(jù)《測量不確定度評定與表示，JJF1059.1-2012》和《化學分析中不確定度的評估指，CNAS—GL06》等技術規(guī)范要求，對液相色譜法測定黃瓜中三羥基克百威的不確定度進行評估，分析該方法不確定度分量及其來源，確保檢測結果更加真實有效。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

島津液相色譜儀（配熒光檢測器與柱后衍生系統(tǒng)）；柱子為C8（4.0×250mm），5?m；移液槍為Eppendorf。

1.2 實驗步驟

精確稱量25.00g樣品置于打樣機中，移取50.0mL乙腈，均勻破碎2min后過濾，匯集濾液40±5mL到裝有6±1g氯化鈉的100mL具塞量筒中，在離心機中離心3min后取出靜置15min，等待分層充足后。在具塞量筒中移取10.00mL乙腈上清液，放置在150mL的燒杯中，通過65℃水浴鍋進行加熱，同時緩緩氮吹，將乙腈蒸發(fā)近干，加入甲醇+二氯甲烷（比例為1+99）2.0mL洗凈，待凈化。用4.0mL甲醇+二氯甲烷（1+99）活化氨基柱，當溶液面到達氨基柱吸附層表面的時候，立刻加入待凈化的溶液，用15 mL玻璃試管將洗脫液進行收集，用2 mL甲醇+二氯甲烷（1+99）洗具塞量筒后過柱，并再重復一次。將試管放置在氮吹儀上，設置水浴溫度為45℃，氮吹蒸發(fā)至溶液近干，用甲醇定容至2.5mL?；靹蚝螅捎?.45μm濾膜進行過濾，吸取20.0μL樣品溶液注入液相色譜儀中，等待分析。檢測時，室溫保持在16～26℃。

2 結果與討論

2.1 建立數(shù)學模式

ω為樣品中農(nóng)藥的含量（mg/kg）；為標準液中三羥基克百威濃度含量（μg/mL）；為標準液中三羥基克百威峰面積（mV*s）；為樣品中三羥基克百威峰面積（mV*s）；m為樣品的質量（g）；為提取液的總體積（mL）；為提取液分取的體積（mL）；為樣品溶液定容體積（mL）。

2.2 分析不確定度的來源

HPLC檢測黃瓜中三羥基克百威的標準不確定度主要來源：標準液濃度、試樣稱量、樣品前處理溶液體積、標準溶液峰面積、試樣峰面積、檢測方法重復性等。

從檢測方法可知，各參數(shù)相互獨立，合成標準不確定度計算可采用相對標準不確定度的合成。

2.3 量化不確定度分量

2.3.1 由實驗總重復性導出的相對不確定度μrel（rep）。同一樣品溶液進樣5次，檢測到農(nóng)藥濃度分別為0.178 mg/kg、0.187 mg/kg、0.184 mg/kg、0.182 mg/kg、0.179 mg/kg。平均濃度為0.182 mg/kg。計算不確定度：

2.3.2 標準溶液濃度導致的相對標準不確定度評定。（1）標準液純度引入的相對標準不確定度。實驗用三羥基克百威標準溶液母液，濃度為100 μg/mL，1.0 mL/支，其擴展不確定度為-0.12 ～0.12μg/mL（k=2），則：

（2）稀釋過程引入的相對標準不確定度評定。將三羥基克百威標準母液1mL移至10mL容量瓶（A級）中，制備成濃度為10μg/mL的標準儲備液。再用移液槍吸取200μL標準儲備液至定容體積為10mL的容量瓶（A級）中，用甲醇進行定容，配置成濃度為0.2μg/mL的三羥基克百威標準液。

（3）合成相對不確定度評定。

2.3.3 測定標準溶液峰面積導致的相對標準不確定度評定。根據(jù)《液相色譜儀檢定規(guī)程，JJG 705-2014》操作測定樣本。儀器精準度、進樣偏差最終均反映在試樣峰，相同條件下對標準溶液中三羥基克百威含量進行平行6次檢測，如表1所示。該不確定度通過連續(xù)平行檢測計算，屬于A類評定。

（1）標準色譜峰面積重復測量導致的相對標準不確定度。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，計算可得：

（2）儀器產(chǎn)生的相對標準不確定度。依據(jù)儀器檢定信息，其重復性誤差為，則：

（3）標準溶液色譜峰面積測定不確定度的合成。

2.3.4 試樣色譜峰面積檢測引入的相對標準不確定度評定。（1）由試樣色譜峰面積重復測量導致的相對標準不確定度。通過該不確定度重復進樣計算，屬于A類評定。對樣本中三羥基克百威含量6次重復測定結果分別為49618、49345、50750、49970、48663、49212mV*s，平均值49593mV*s，則

（2）由檢測儀器產(chǎn)生的相對標準不確定度。依據(jù)儀器檢定信息，其定量重復性誤差為（B類評定），則：

（3）由試樣峰面積測定引入的相對標準不確定度合成。

2.3.5 樣品稱量時帶入的相對標準不確定度μrel（m）評定。樣品稱量過程中使用的天平（最小稱量值為0.01g），其最大誤差為-0.05～0.05g，因此由稱量帶入的不確定度為：

2.3.6 試樣前處理溶液體積引入的相對標準不確定度評定。（1）提取過程中溶液總體積導致的相對標準不確定度。50 mL單標線胖肚移液管（A級）的容量允許誤差范圍為±0.050mL，則。

乙腈的膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃，而檢測實驗室的溫度變化范圍在-3～3℃之間，因此。

計算樣品提取液總體積引入的相對標準不確定度：

3 討論

由表2可知，對檢測結果影響最大的不確定度分量為標準峰面積的測定（A標），其次是樣品總重復性測定（rep）、樣品峰面積測定（A樣）和前處理過程溶液體積（V）等。因此在檢測過程中應按儀器操作規(guī)程做好儀器各項調試工作，確保儀器溫度、壓力等儀器條件穩(wěn)定運行，同時檢測所用的儀器、器材、容器和檢測場所應保持清潔，以免沾染其他物質影響檢測結果準確性。注意樣品前處理操作規(guī)范，做到均勻取樣。此外，還應特別注意檢測過程中加強對上述主要影響因素的控制，減少測量的不確定度，提高測量結果的準確性和可靠性。

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