解淀粉芽胞桿菌WH1G與咪鮮胺協(xié)同防治草莓炭疽病

谷春艷 蘇賢巖 楊雪 臧昊昱 陳雨 王學(xué)峰

摘要 通過室內(nèi)測定8種化學(xué)藥劑和拮抗細(xì)菌解淀粉芽胞桿菌WH1G對草莓炭疽病菌的毒力，將毒力最強(qiáng)的化學(xué)藥劑與WH1G進(jìn)行復(fù)配，探討復(fù)配劑對草莓炭疽病菌的室內(nèi)毒力及田間防治效果。室內(nèi)生物測定結(jié)果表明，8種常見化學(xué)藥劑中咪鮮胺對草莓炭疽病菌的毒力最強(qiáng)，其EC50為0.045 3 mg/L，在較低濃度下能有效抑制草莓炭疽病菌的生長，與生防菌有較好的生物相容性；解淀粉芽胞桿菌WH1G對草莓炭疽病菌菌絲生長具有較強(qiáng)的抑制作用，含菌量為1.0×1010cfu/mL時抑制率達(dá)89%；將咪鮮胺（0.045 3 mg/L）與解淀粉芽胞桿菌WH1G（2.3×106 cfu/mL）復(fù)配，V（咪鮮胺）∶V（WH1G）配比為5∶5時對病菌抑制的增效作用和防治效果最好，毒性比率為1.432，防效為69.94%。復(fù)配劑對草莓炭疽病的田間防效達(dá)67.91%，顯著高于單劑防效，且咪鮮胺使用量只有單劑使用量的1/2，表明二者復(fù)配不僅可以提高防效，還能有效減少化學(xué)藥劑的使用量。

關(guān)鍵詞 草莓炭疽病； 解淀粉芽胞桿菌； 咪鮮胺； 協(xié)同防治

中圖分類號： S 668.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017209

Abstract Toxicities of 8 fungicides and Bacillus amyloliquefaciens WH1G against strawberry anthracnose were tested in this study. The mixture of the fungicide with the strongest toxicity and antagonistic bacteria WH1G was detected for its laboratory toxicity and control effect in the fields against strawberry anthracnose. The results showed that the toxicity of prochloraz was the strongest among 8 fungicides with the EC50 value of 0.045 3 mg/L. It could effectively inhibit the mycelia growth of C.gloeosporioides under lower dosage， and was compatible with strain B.amyloliquefaciens WH1G. 1.0×1010cfu/mL WH1G could strikingly inhibit the growth of C.gloeosporioides with the inhibition ratio of 89%. By combining 0.045 3 mg/L prochloraz with 2.3×106 cfu/mL B.amyloliquefaciens WH1G fermentation broth at the volume ratio of 5∶5， the toxicity ratio and the control efficacy were 1.432 and 69.94%， respectively， prior to the rest of the tested reagent combinations. The control efficacy of compound biopesticide was 67.91% against strawberry anthracnose in the field， which was better than that when each of them used alone. Meanwhile， the amount of prochloraz was reduced by 50% compared to that when used alone. Therefore， the combination of prochloraz and strain WH1G can not only reduce the usage of chemicals， but also promote the biocontrol efficacy.

Key words strawberry anthracnose； Bacillus amyloliquefaciens WH1G； prochloraz； synergistic control

由炭疽菌Colletotrichum spp.引起的草莓炭疽病是草莓苗期和移栽期的重要病害，該病主要危害匍匐莖和根冠，造成根冠腐爛，最終導(dǎo)致植株萎蔫死亡[1]。近幾年來，由于草莓地連作現(xiàn)象普遍、復(fù)種年限延長以及抗病品種缺乏，炭疽病蔓延迅速，已成為草莓苗期的主要病害，嚴(yán)重制約了草莓種植業(yè)的健康發(fā)展[2]。

目前對草莓炭疽病的防治主要以化學(xué)防治為主，多采用咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯等化學(xué)藥劑進(jìn)行防治。使用化學(xué)藥劑雖在短時期內(nèi)能達(dá)到很好的防效，但同時也會造成果實農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染及病菌產(chǎn)生抗藥性等問題[34]。據(jù)報道，草莓炭疽病菌已對多種化學(xué)藥劑產(chǎn)生了抗藥性[57]。生物防治不僅對人畜安全，而且具有綠色、環(huán)保、作用時間長、病菌不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，因而日益受到人們的關(guān)注，但其也存在一些不足，如田間施用后藥效發(fā)揮較慢、防治效果及防效穩(wěn)定性差等，這些缺點嚴(yán)重制約了生防制劑的推廣[8]。目前針對草莓炭疽病生防菌的研究多數(shù)停留在拮抗菌的篩選、鑒定及生物學(xué)特性方面[1，3，9]，開發(fā)并已登記的生防菌中田間防治效果好的菌株屈指可數(shù)[1011]。

利用生物防治與化學(xué)防治相結(jié)合的防治策略，既能減少化學(xué)藥劑的施用量、提高生物防治的穩(wěn)定性，又能達(dá)到有效控制病害的效果，綜合運用了生物防治與化學(xué)防治方法的優(yōu)點，因此在植物病害防治領(lǐng)域日益受到重視，且取得了較好的進(jìn)展[1215]，但目前利用生防菌與化學(xué)藥劑協(xié)同防治草莓病害的研究還少有報道[8，16]。據(jù)此，本研究擬從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)常用的化學(xué)藥劑中篩選出對草莓炭疽病防效較好并和解淀粉芽胞桿菌生物相容性好的化學(xué)藥劑進(jìn)行復(fù)配，探討化學(xué)藥劑與解淀粉芽胞桿菌協(xié)同防治草莓炭疽病的效果，為生產(chǎn)中生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥的綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens WH1G，由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所水稻病害防治課題組分離獲得[17]。采用改良的NA培養(yǎng)基（1.0 g牛肉浸膏，5.0 g酵母膏，5.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，10.0 g蔗糖，20.0 g瓊脂和1 000 mL蒸餾水，pH 6.8～7.0），在恒溫恒濕培養(yǎng)箱28℃中培養(yǎng)。

草莓炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides CF8G，由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所水稻病害防治課題組分離獲得。病菌用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g和蒸餾水1 000 mL），在恒溫恒濕培養(yǎng)箱28℃中培養(yǎng)。

化學(xué)藥劑：9種化學(xué)藥劑的含量、劑型及生產(chǎn)廠家見表1。

1.2 藥劑毒力測定

采用菌絲生長速率法[18]。分別用97%咪鮮胺原藥等8種供試藥劑配制含不同梯度濃度藥劑的PDA平板。其中97%咪鮮胺原藥、98%氟啶胺原藥在PDA培養(yǎng)基中的系列梯度濃度設(shè)計為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L；97%氟環(huán)唑原藥及97%戊唑醇原藥的梯度濃度設(shè)計為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L；96%苯醚甲環(huán)唑原藥的梯度濃度設(shè)計為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L； 95%啶酰菌胺原藥、95%腈菌唑懸浮劑及97%吡唑醚菌酯原藥的梯度濃度設(shè)計為1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L，將草莓炭疽病菌菌塊（直徑5.0 mm）放在含藥平板中央，放置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用無菌水作為對照，各處理重復(fù)3次。待對照菌落長滿培養(yǎng)皿2/3時，采用十字交叉法量取各處理的菌落直徑，計算平均抑制率。

平均抑制率=[（對照組菌落直徑平均值-處理組菌落直徑平均值）/（對照菌落直徑平均值-5.0）] ×100%。

1.3 解淀粉芽胞桿菌WH1G對草莓炭疽病菌抑菌活性測定

將解淀粉芽胞桿菌WH1G接種于5 mL改良NA液體培養(yǎng)基中，置于28℃搖床180 r/min培養(yǎng)48 h后用無菌水稀釋成菌含量1.0×1010cfu/mL，采用平板對峙法[9] 測定其對草莓炭疽病菌的抑制活性。用直徑為5 mm的無菌打孔器在草莓炭疽病菌菌落邊緣打取菌餅，接種于PDA平板中央，在距離中心3 cm處對稱放置4個直徑為5 mm的濾紙片，其中3個濾紙片加2 μL解淀粉芽胞桿菌WH1G菌懸液，另外一個濾紙片滴加2 μL NA液體培養(yǎng)基，另設(shè)清水對照，每處理設(shè)3次重復(fù)，將平板置于28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。待對照菌落長至培養(yǎng)皿2/3時，用十字交叉法測量菌落直徑，計算平均抑制率。

1.4 化學(xué)藥劑對解淀粉芽胞桿菌WH1G生物活性的影響

將1.2篩選出來的對草莓炭疽病菌毒力較強(qiáng)的化學(xué)藥劑分別配成質(zhì)量濃度為50、100、150、200 mg/L的改良NA培養(yǎng)基平板，將10 μL解淀粉芽胞桿菌WH1G的菌懸液滴在含藥平板中央，用玻璃棒均勻涂布于培養(yǎng)基表面，每處理重復(fù)3皿，以加同等體積的無菌水為對照，28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2 d。分別采用平板稀釋法檢測菌體生長情況，統(tǒng)計并記錄菌落數(shù)量。

1.5 咪鮮胺與解淀粉芽胞桿菌WH1G復(fù)配劑的毒力測定

1.5.1 單劑對草莓炭疽病菌的毒力測定

用無菌水將解淀粉芽胞桿菌WH1G的菌懸液配制成不同含菌量的菌懸液，分別為1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109 cfu/mL。同時將97%咪鮮胺TC配制成不同質(zhì)量濃度梯度的藥液，分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L。

采用生長速率法測定單劑毒力。用十字交叉法測量炭疽菌在含不同質(zhì)量濃度的咪鮮胺平板及不同含菌量的解淀粉芽胞桿菌WH1G平板上的菌落直徑，根據(jù)各處理的平均菌落直徑計算抑制率。將抑制率換算成抑制幾率值。分別根據(jù)咪鮮胺質(zhì)量濃度對數(shù)（X）與抑制幾率值（Y）、生防菌濃度對數(shù)（X）與抑制幾率值（Y），采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算出各處理的回歸方程Y=aX+b、EC50及相關(guān)系數(shù)r。

1.5.2 復(fù)配劑對草莓炭疽病菌的毒力測定

根據(jù)97%咪鮮胺TC及解淀粉芽胞桿菌WH1G單劑的毒力測定結(jié)果，分別配制兩種單劑的有效中濃度為藥液。再將咪鮮胺與生防菌WH1G按體積比為10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10配成10種配比的復(fù)配液。以加入等量無菌水為空白對照，每處理設(shè)3次重復(fù)。測量各處理平板的菌落直徑，計算平均抑制率、預(yù)期抑制生長率及毒性比率。根據(jù)毒性比率值，判斷不同配方的協(xié)同作用效果。

毒性比率>1，表示為增效作用；毒性比率<1，表示為拮抗作用；毒性比率=1，表示為相加作用[19]。其計算公式為：

毒性比率=實際抑制生長率/預(yù)期抑制生長率。

預(yù)期抑制生長率=生防菌WH1G菌懸液EC50劑量實際抑制率×配比中的百分率+咪鮮胺EC50劑量實際抑制率×配比中的百分率。

已有研究結(jié)果[2427]表明，化學(xué)藥劑有助于生防微生物克服自然環(huán)境中的各種障礙，彌補(bǔ)生防菌發(fā)揮作用慢、田間防效不穩(wěn)定等缺點，從而更好地發(fā)揮生物防治作用。但是對于生防微生物的安全性、質(zhì)保期、使用規(guī)范及實現(xiàn)化學(xué)藥劑和生防菌協(xié)同增效的具體作用機(jī)制還有待于深入研究，從而為菌劑更好地開發(fā)利用提供指導(dǎo)作用。

草莓炭疽病的防治只有堅持“預(yù)防為主、綜合防治”的植保方針，以農(nóng)業(yè)防治為基礎(chǔ)，運用生物防治和高效低毒農(nóng)藥協(xié)同防治的多種措施才能達(dá)到理想的防治效果。

參考文獻(xiàn)

[1] 李娟，劉丹梅，王東來，等.草莓炭疽病拮抗放線菌DTJ-24的篩選及鑒定[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，28（5）：20862089.

[2] 吉沐祥，楊敬輝，吳祥，等.草莓炭疽病的生物防治[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，28（6）：14981500.

[3] 李娟，宋潔，姜路路，等.草莓炭疽病拮抗芽胞桿菌TJX-012的篩選與鑒定[J].遼東學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2015， 22（1）： 2326.

[4] 吳祥，吉沐祥，陳宏州，等.句容地區(qū)草莓炭疽病病原菌的鑒定及防治藥劑篩選[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，29（6）：15101513.

[5] BERNSTEIN B， ZEHR E I， DEAN R A， et al. Characteristics of Colletotrichum from peach， apple， pecan， and other hosts [J].Plant Disease， 1995， 79： 478482.

[6] SMITH B J， BLACK L L. Greenhouse efficacy of fungicides for control of anthracnose crown rot of strawberry [M]∥ADAM D， JAMES J L. The strawberry into the 21st century.Portland： Timber Press， 1991： 221226.

[7] LAMONDIA J.Inhibition with benomyl to growth in vitro of Colletotrichum acutatum and C.fragariae and strawberry fruit infection by benomyl-resistant isolates of C.acutatum [J].Advances in Strawberry Research，1995， 14： 2530.

[8] 姚克兵，張玉軍，王勁根，等.枯草芽胞桿菌和吡唑醚菌酯協(xié)同防治草莓病害[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，29（10）：23972401.

[9] 魏彩燕，毛雪琴，柴榮耀，等.草莓炭疽病生防菌株MT-06的鑒定及生物學(xué)特性[J].菌物學(xué)報，2010，29（4）：481487.

[10]張雪，張志宏，劉月學(xué)，等.木霉菌劑提高“紅顏”草莓炭疽病抗性的效應(yīng)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，19（8）：153156.

[11]FREEMAN S， MINZ D， KOLESNIK I， et al. Trichoderma biocontrol of Colletotrichum acutatum and Botrytis cinerea and survival in strawberry [J]. European Journal of Plant Pathology， 2004， 110： 361370.

[12]常有宏，劉郵洲，王宏，等.嘧霉胺與枯草芽胞桿菌B-916協(xié)同防治梨黑斑病[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，26（6）：12271232.

[13]韓麗，常建民，張柏林，等.枯草芽胞桿菌B26與化學(xué)藥劑協(xié)同防治木材藍(lán)變[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，41（4）：126130.

[14]黃小琴，劉勇，張蕾，等.煙草青枯病生防芽孢桿菌協(xié)同防治藥劑的篩選和復(fù)配[J].農(nóng)藥，2015，54（11）：848851.

[15]周子燕，李昌春，胡本進(jìn)，等.多黏類芽孢桿菌和井岡霉素A配比對水稻紋枯病菌的室內(nèi)毒力測定及田間藥效[J].農(nóng)藥，2014，53（7）：528530.

[16]胡德玉，錢春，劉雪峰.草莓炭疽病研究進(jìn)展[J].中國蔬菜，2014（12）：914.

[17]谷春艷，張愛芳，楊雪，等.水稻稻瘟病拮抗細(xì)菌WH1G的篩選鑒定及其抑菌活性[J].植物保護(hù)，2016，42（4）：4855.

[18]SCHWINN F.Recommended methods for the detection and measurement of resistance of plant pathogens to fungicides： method for fungicide resistance in late blight of potato [J].Plant Protection Bulletin， 1982， 30： 6971.

[19]尹敬芳.生物-化學(xué)協(xié)同防治辣椒疫病菌藥合劑初步研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[20]王春花.草莓炭疽病在東港地區(qū)的發(fā)生及防治[J].北方果樹，2013（2）：38.

[21]姚紅燕，張慶，張松柏.寧波地區(qū)草莓炭疽病菌株分離和生物學(xué)特性研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（2）：376379.

[22]向發(fā)云，韓永超，曾祥國，等.湖北省草莓育苗期炭疽病病害調(diào)查[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（24）：56505653.

[23]楊敬輝，陳宏州，肖婷，等.草莓炭疽病病原鑒定及其12種殺菌劑的毒力測定[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，28（6）：25272531.

[24]陳志誼，劉永鋒，陸凡.井岡霉素和生防菌Bs-916協(xié)同控病作用及增效機(jī)理[J].植物保護(hù)學(xué)報，2003，30（4）：429434.

[25]劉郵洲， 陳志誼， 劉永鋒， 等. 枯草芽孢桿菌sf628和咪鮮胺錳鹽協(xié)同作用防治番茄枯萎病[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2011， 27（6）： 12491253.

[26]KLOEPPER J W， LEONG J， TEINTZE M， et al. Enhance plant growth by sidrophores produced by plant growth promoting Rhizobacteria [J]. Nature， 1980， 286： 885886.

[27]WELLER D M. Biological control of soil-borne plant pathogens in the Rhizosphere with bacteria [J]. Annual Review of Phytopathology， 1988， 26：397407.

（責(zé)任編輯：楊明麗）