啶酰菌胺與氟啶胺復(fù)配物對(duì)水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的增效作用研究

劉妍 張亞 項(xiàng)雅琴 王翀 廖曉蘭

摘要 為探明啶酰菌胺與氟啶胺復(fù)配物對(duì)水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的增效潛力，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定啶酰菌胺和氟啶胺復(fù)配物對(duì)水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的抑制效果，并根據(jù)Wadley方法評(píng)價(jià)復(fù)配物增效作用。結(jié)果表明：啶酰菌胺和氟啶胺對(duì)水稻紋枯病菌均具有抑制作用，其EC50分別為0.483 6 μg/mL和0.054 1 μg/mL。將啶酰菌胺和氟啶胺按照1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶3、3∶2、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1的比例進(jìn)行復(fù)配，結(jié)果表明：按照1∶2、3∶2、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1復(fù)配對(duì)水稻紋枯病菌均具有增效作用，其中以3∶1和3∶2比例復(fù)配增效最佳，增效系數(shù)分別為7.7和5.46；以1∶1、1∶3、1∶4、1∶5和2∶3復(fù)配對(duì)水稻紋枯病菌具有相加作用。啶酰菌胺和氟啶胺對(duì)草莓灰霉病菌也具有抑制作用，其EC50分別為1.637 1 μg/mL和0.028 3 μg/mL。將啶酰菌胺和氟啶胺按照上述相同11種比例進(jìn)行復(fù)配，結(jié)果顯示比例為1∶5、1∶4、1∶1、5∶1、4∶1等8種復(fù)配物對(duì)草莓灰霉病菌具有相加作用，其中以2∶1和1∶2比例復(fù)配相加效果最佳，增效系數(shù)分別為1.30和1.00，但比例為3∶2等其他比例復(fù)配則對(duì)草莓灰霉病菌表現(xiàn)出拮抗作用。

關(guān)鍵詞 啶酰菌胺； 氟啶胺； 水稻紋枯病菌； 草莓灰霉病菌； 復(fù)配物； 增效作用

中圖分類號(hào)： S 435.11， S 436.68

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017230

Abstract In order to clarify the synergism of boscalid and fluazinam against Rhizoctonia solani and Botrytis cinerea， the inhibition effects of boscalid-fluazinam mixtures to R.solani and B.cinerea were investigated by mycelial growth rate test. The results showed that they both have notable inhibition effects against R.solani and B.cinerea， with the EC50 values of 0.483 6 μg/mL and 0.054 1 μg/mL， respectively. The mixtures of of boscalid and fluazinam at the ratio of 1∶2， 3∶2， 5∶1， 4∶1， 3∶1 and 2∶1 had synergism to R.solani. The mixtures at the ratio of 3∶1 and 3∶2 demonstrated the best antibacterial activities with the synergistic coefficients of 7.70 and 5.46， respectively. While the mixtures at the ratio of 1∶1， 1∶3， 1∶4， 1∶5 and 2∶3 showed only additive effects. In addition， the boscalid and fluazinam had the inhibition effect against B.cinerea， with the EC50 values of 1.637 1 μg/mL and 0.028 3 μg/mL， respectively. The mixtures at the ratio of 1∶5， 1∶4， 1 ∶1， 5∶1， 4∶1 and other 3 composites showed additive effects against B.cinerea. The ratios with the best additive effect were 2∶1 and 1∶2， with the synergistic coefficients of 1.30 and 1.00， respectively. However， the mixtures at the ratios of 3∶2 and other ratios showed antagonism.

Key words boscalid； fluazinam； Rhizoctonia solani； Botrytis cinerea； mixture； synergism

水稻紋枯病是由立枯絲核菌Rhizoctonia solani侵染引起的一種重要水稻真菌病害，通常在水稻分蘗末期或節(jié)間伸長(zhǎng)早期開(kāi)始發(fā)病，菌絲在高溫高濕條件下侵入葉片，在葉枕下形成圓形、橢圓形或長(zhǎng)方形灰綠色水漬狀斑點(diǎn)向四周擴(kuò)張，隨著病情發(fā)展，病斑中心變成灰白色，邊緣呈紫褐色[1]。病原菌菌絲可通過(guò)產(chǎn)生侵入釘穿透水稻表皮或直接通過(guò)氣孔侵入寄主體內(nèi)，受侵染細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)產(chǎn)生顆粒物質(zhì)并裂解死亡[24]。目前，隨著雜交水稻的推廣，高產(chǎn)品種的應(yīng)用，耕作制度的變更，環(huán)境條件的變化，水稻紋枯病的危害日益加重，一般可使水稻減產(chǎn)5%～10%，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)30%～50%[5]。

草莓灰霉病是由灰葡萄孢Botrytis cinerea侵染引起的一種重要的草莓真菌病害。病原菌在花期通過(guò)表皮或傷口侵入果實(shí)、花瓣、葉片等組織造成危害。發(fā)病初期在花瓣和花萼處出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，后期呈褐色斑點(diǎn)且果實(shí)腐爛，同時(shí)在患病處形成分生孢子。病菌侵染葉片時(shí)一般從基部葉緣侵入逐漸形成黃褐色倒“V”字形病斑，侵染花瓣掉落時(shí)形成圓形壞死斑點(diǎn)[67]。近期，謝學(xué)文等[8]研究發(fā)現(xiàn)溫室中感病的草莓表現(xiàn)出花萼背面和果枝變紅，果實(shí)不發(fā)育，形成僵果。誘發(fā)草莓灰霉病發(fā)生的重要因素是濕度，相對(duì)濕度為64%時(shí)，爛果率低于10%；而相對(duì)濕度為80%時(shí)，爛果率上升至80%[7]。同時(shí)草莓種植密度越大，草莓灰霉病發(fā)病率越高；淺溝廂草莓由于排濕系統(tǒng)比深溝廂草莓差，因此發(fā)病率高；過(guò)量使用氮肥也會(huì)造成草莓灰霉病發(fā)病加重[9]。一般可使草莓減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)50%以上[8]。

水稻紋枯病和草莓灰霉病均是由半知菌亞門真菌侵染引起。水稻紋枯病菌以菌絲繁殖和侵染，主要侵染禾本科農(nóng)作物；草莓灰霉病菌主要以分生孢子繁殖，通過(guò)分生孢子和菌絲侵染，可侵染多種蔬菜、水果和觀賞植物[10]。水稻紋枯病菌在不良環(huán)境條件下形成黑褐色菌核，在高溫高濕環(huán)境下發(fā)生嚴(yán)重；草莓灰霉病菌在少數(shù)情況下會(huì)形成菌核，在高濕低溫環(huán)境下發(fā)生嚴(yán)重。

目前，這兩種病害主要采用農(nóng)業(yè)防治、生物防治和化學(xué)防治，其中化學(xué)防治是最重要的方法，不僅可節(jié)省勞力和成本，而且能起到立竿見(jiàn)影的效果。井岡霉素是近年來(lái)用于防治水稻紋枯病的主要藥劑，其主要是抑制水稻紋枯病菌菌絲正常分支并誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗藥性[1112]。陳小龍等[12]認(rèn)為水稻紋枯病菌對(duì)井岡霉素不易產(chǎn)生抗藥性。但吳婕等[13]通過(guò)試驗(yàn)證明四川地區(qū)水稻紋枯病菌對(duì)井岡霉素的抑制中濃度逐年上升，認(rèn)為已經(jīng)產(chǎn)生了抗藥性。所以水稻紋枯病菌是否對(duì)井岡霉素產(chǎn)生了抗藥性這一問(wèn)題還有待考證。除了井岡霉素外，吉沐祥等[14]研究發(fā)現(xiàn)苯醚·己唑醇對(duì)水稻紋枯病的防治效果可達(dá)56.72%，與噻呋酰胺相當(dāng)。宋益民等[15]認(rèn)為250 g/L嘧菌酯懸浮劑對(duì)水稻紋枯病的防效可達(dá)87.53%，而且丁香菌酯、丙環(huán)唑、戊唑醇、甲基硫菌靈和噻呋酰胺等殺菌劑對(duì)水稻紋枯病菌也有較好的抑制作用。利用化學(xué)藥劑防治草莓灰霉病方面，張傳博等[16]研究發(fā)現(xiàn)乙蒜·丁子香酚、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺和武夷菌素均對(duì)草莓灰霉病菌有一定抑制效果，它們的EC50分別為0.075、2.266、3.704、4.083 7、22.771、55.277 mg/L。然而，張亞等[17]發(fā)現(xiàn)湖南地區(qū)的草莓灰霉病菌已經(jīng)對(duì)多菌靈、腐霉利和嘧霉胺產(chǎn)生抗藥性。趙虎等[18]發(fā)現(xiàn)南京、鎮(zhèn)江地區(qū)草莓灰霉病菌已經(jīng)對(duì)多菌靈、腐霉利、乙霉威、嘧霉胺和醚菌酯產(chǎn)生抗藥性。由于過(guò)量使用化學(xué)藥劑，水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌已經(jīng)對(duì)多種化學(xué)藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，為緩解這一現(xiàn)象，尋找新的殺菌劑或新的途徑十分必要，而藥劑復(fù)配是一個(gè)很好的延緩抗藥性產(chǎn)生的研究方向。

啶酰菌胺是一種新型煙酰胺類內(nèi)吸性殺菌劑，該藥是線粒體呼吸鏈上的琥珀酸輔酶Q還原酶的抑制劑，通過(guò)阻礙三羧酸循環(huán)來(lái)抑制真菌的呼吸作用[1920]，對(duì)灰霉病、菌核病和白粉病等真菌病害具有很好的效果。在過(guò)去研究中發(fā)現(xiàn)啶酰菌胺在草莓、黃瓜、番茄、葡萄和土壤中的殘留量均低于歐盟、韓國(guó)和日本制定的最大殘留限量[2124]，因此啶酰菌胺是較為安全的殺菌劑。氟啶胺是一種2，6-二硝基苯胺類化合物，對(duì)植食性螨類、葡萄孢屬、交鏈孢屬和十字花科植物根腫病等有顯著防治效果[2527]。許秀瑩等[28]研究發(fā)現(xiàn)由于土壤對(duì)氟啶胺屬于物理吸附，所以在土壤中很難淋溶。同時(shí)，何建玲[29]研究發(fā)現(xiàn)土壤中的腐殖酸和十二烷基苯磺酸鈉對(duì)氟啶胺光解有促進(jìn)作用。因此氟啶胺是一種不易隨雨水流動(dòng)污染其他土地和河流、比較安全且對(duì)環(huán)境危害小的殺菌劑。目前，有關(guān)這兩種藥劑在我國(guó)均有一定的用藥史，啶酰菌胺用于防治灰霉病的用藥史不足20年，而用于防治水稻紋枯病的研究鮮見(jiàn)報(bào)道；氟啶胺用于防治灰霉病和水稻紋枯病的報(bào)道也相對(duì)較少，因此，明確這兩種藥劑及復(fù)配物對(duì)水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的毒力及增效作用，對(duì)于指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有重要意義。本研究分別測(cè)試了啶酰菌胺和氟啶胺對(duì)水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的毒力，并采用Wadley法評(píng)價(jià)其復(fù)配物增效作用，旨在提高藥劑的使用壽命，延緩病菌的抗藥性，同時(shí)，也豐富了防治兩種病害的新藥劑。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani AG-1（采自瀏陽(yáng)市北盛鎮(zhèn)和長(zhǎng)沙縣金井鎮(zhèn)）和草莓灰霉病菌Botrytis cinerea Pers. ex. Fr.（采自衡東縣新塘鎮(zhèn)和郴州市北湖區(qū)華塘鎮(zhèn)）各2株由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物農(nóng)藥研究室分離、保存。98%啶酰菌胺原藥和98%氟啶胺原藥，購(gòu)自上海秦巴化工有限公司。VS-840K-U潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ME204E分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；1 000 μL移液槍，德國(guó)Eppendorf；MJP-250型霉菌培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LDZX-75KB滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 啶酰菌胺和氟啶胺毒力測(cè)定

利用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定啶酰菌胺和氟啶胺對(duì)水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的毒力（各選2株菌進(jìn)行測(cè)試）。將啶酰菌胺和氟啶胺用適量丙酮溶解，用含適量吐溫-80的無(wú)菌水制備成母液，接著按表1所列質(zhì)量比用無(wú)菌水稀釋為系列濃度（表1），加入熔化后的滅菌PDA中，制成含藥PDA平板。同時(shí)設(shè)置不加藥劑的無(wú)菌水空白對(duì)照，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，在平板中央接入直徑約7 mm的新鮮菌餅，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24 h，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑并計(jì)算平均值，按照以下公式計(jì)算不同濃度處理下的菌絲生長(zhǎng)抑制率，根據(jù)所得的抑制率用DPS 6.55軟件計(jì)算出回歸方程和EC50。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=[（對(duì)照菌落直徑增長(zhǎng)長(zhǎng)度-處理濃度菌落直徑增長(zhǎng)長(zhǎng)度）/對(duì)照菌落直徑增長(zhǎng)長(zhǎng)度]×100%。

1.3 最佳配比預(yù)選

采用交互測(cè)定法進(jìn)行最佳配比的篩選[3031]。以啶酰菌胺和氟啶胺的EC50為基礎(chǔ)，按EC50劑量百分比設(shè)置2個(gè)單劑和11個(gè)混劑，共13個(gè)處理（表1），每處理3個(gè)重復(fù)。毒力測(cè)定同1.2，測(cè)量各菌落直徑增加長(zhǎng)度并計(jì)算實(shí)際抑制率，再根據(jù)下列公式計(jì)算各配比的毒性比率。

預(yù)期抑制濃度=啶酰菌胺EC50劑量實(shí)際抑制率×配比中啶酰菌胺EC50劑量百分比+氟啶胺EC50劑量實(shí)際抑制率×配比中氟啶胺EC50劑量百分比。

毒性比率=實(shí)際抑制率/預(yù)期抑制率；毒性比率>1.25時(shí)，表現(xiàn)為增效作用；毒性比率<0.75時(shí)，表現(xiàn)為拮抗作用；0.75≤毒性比率≤1.25時(shí)表現(xiàn)為相加作用。

1.4 復(fù)配劑毒力測(cè)定

利用生長(zhǎng)速率法測(cè)定啶酰菌胺和氟啶胺混劑對(duì)水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的毒力（各選2株菌進(jìn)行測(cè)試）。將啶酰菌胺和氟啶胺按照表1中的比例進(jìn)行復(fù)配，加入熔化的滅菌PDA中，制成含藥PDA平板。同時(shí)設(shè)置不加藥劑的無(wú)菌水空白對(duì)照，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，在平板中央接入直徑約7 mm的新鮮菌餅，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24 h。按照1.2的測(cè)量和計(jì)算方法，計(jì)算出各復(fù)配藥劑的EC50和回歸方程，再根據(jù)Wadley方法計(jì)算增效系數(shù)（SR）評(píng)價(jià)混劑的增效作用。

式中a、b分別代表兩種藥劑在混劑中所占比例，ob為實(shí)際觀察值，th為理論值。SR>1.5為增效作用；0.5≤SR≤1.5為相加作用；SR<0.5為拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 啶酰菌胺和氟啶胺對(duì)兩種病菌的抑制效果

試驗(yàn)結(jié)果表明，啶酰菌胺和氟啶胺對(duì)水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌均表現(xiàn)出較好的抑制效果。氟啶胺對(duì)水稻紋枯病菌的毒力最強(qiáng)，EC50和相關(guān)系數(shù)分別為0.054 1 μg/mL和0.986 9；啶酰菌胺對(duì)水稻紋枯病菌的EC50和相關(guān)系數(shù)分別為0.483 6 μg/mL和0.984 6。氟啶胺對(duì)草莓灰霉病菌的毒力最強(qiáng)，EC50和相關(guān)系數(shù)分別為0.028 3 μg/mL和0.985 7；啶酰菌胺對(duì)草莓灰霉病菌的EC50和相關(guān)系數(shù)分別為1.637 1 μg/mL和0.985 1。

2.2 啶酰菌胺和氟啶胺最佳配比的預(yù)選

以啶酰菌胺和氟啶胺對(duì)水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的近似EC50（分別為0.48，0.05，1.64和0.028 μg/mL）為基礎(chǔ)，依據(jù)交互測(cè)定法進(jìn)行最佳配比的篩選。結(jié)果表明：啶酰菌胺和氟啶胺按照1∶3和1∶5復(fù)配對(duì)水稻紋枯病菌表現(xiàn)出增效作用，毒性比率分別為1.25和1.33，按照5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、3∶2、2∶3、1∶1、1∶2和1∶4復(fù)配對(duì)水稻紋枯病菌表現(xiàn)出相加作用，毒性比率分別為0.78、0.78、0.87、0.79、0.82、1.02、1.24、1.17和1.15。啶酰菌胺和氟啶胺按照3∶1、2∶1、3∶2、2∶3、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5復(fù)配對(duì)草莓灰霉病菌表現(xiàn)出相加作用，毒性比率分別為0.86、0.94、0.81、1.01、1.01、1.02、1.09、0.97和1.05，按照5∶1和4∶1復(fù)配對(duì)草莓灰霉病菌表現(xiàn)出拮抗作用，毒性比率均為0.73（表2）。

2.3 啶酰菌胺和氟啶胺對(duì)水稻紋枯病菌的增效作用

啶酰菌胺和氟啶胺比例為1∶2、3∶2、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1時(shí)對(duì)水稻紋枯病菌表現(xiàn)出明顯的增效作用，增效系數(shù)分別為1.52、5.46、3.44、2.6、7.7和1.98（表3）。其他配比表現(xiàn)出相加作用。

2.4 啶酰菌胺和氟啶胺對(duì)草莓灰霉病菌的增效作用

啶酰菌胺和氟啶胺比例為1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、5∶1、4∶1和2∶1時(shí)對(duì)草莓灰霉病菌表現(xiàn)出明顯的相加作用，其中按照2∶1和1∶2比例復(fù)配對(duì)草莓灰霉病菌抑制效果最好，增效系數(shù)為1.3和1.0（表4）。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明：啶酰菌胺和氟啶胺均對(duì)水稻紋枯病菌有較好的抑制作用，EC50分別為0.483 6 μg/mL和0.054 1 μg/mL，其中啶酰菌胺對(duì)水稻紋枯病菌的毒力高于陳宏州等[32]得到的結(jié)果（EC50為1.069 2 μg/mL）。同時(shí)，這兩種藥劑的毒力也高于井岡霉素（EC5070.2 μg/mL）、戊唑醇（EC500.509 μg/mL）和丙環(huán)唑（EC500.045 μg/mL）[11，3334]，表現(xiàn)出防治水稻紋枯病的潛力。

啶酰菌胺和氟啶胺對(duì)草莓灰霉病菌的EC50分別為1.637 1 μg/mL和0.028 3 μg/mL，其中啶酰菌胺對(duì)草莓灰霉病菌的毒力高于楊敬輝等的測(cè)定結(jié)果[35]（EC50為3.980 3 μg/mL）。同時(shí)，這兩種藥劑的毒力效果也好于腐霉利（EC503.704 μg/mL）、嘧霉胺（EC504.837 μg/mL）、苯醚甲環(huán)唑（EC502.266 μg/mL）、嘧菌環(huán)胺（EC5022.771 μg/mL）和武夷菌素（EC5055.277 μg/mL）[16]，具有防治草莓灰霉病的潛力。

啶酰菌胺與氟啶胺按照1∶2、3∶2、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1比例復(fù)配對(duì)水稻紋枯病菌表現(xiàn)出較高的增效作用。啶酰菌胺與氟啶胺按照2∶1和1∶2比例混合時(shí)對(duì)草莓灰霉病菌有相加作用。從經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)保的角度考慮，建議田間控制水稻紋枯病可采用啶酰菌胺與氟啶胺2∶1進(jìn)行配比。盡管啶酰菌胺和氟啶胺復(fù)配物對(duì)草莓灰霉病菌未表現(xiàn)出明顯增效作用，但按照2∶1和1∶2配比仍然有一定相加作用，其中以比例2∶1為最佳配比，增效系數(shù)為1.30。

利用復(fù)配來(lái)防治水稻紋枯病和草莓灰霉病可以減少成本、延緩病原菌抗藥性形成，達(dá)到更理想和安全的防治效果。啶酰菌胺和氟啶胺的復(fù)配物對(duì)水稻紋枯病菌的最高增效系數(shù)可達(dá)7.70，明顯高于苯醚甲環(huán)唑與己唑醇按照1.5∶1.0復(fù)配的增效系數(shù)1.14[14]、嘧菌酯與己唑醇按照1∶2復(fù)配的增效系數(shù)1.55[36]以及5%井岡霉素水劑與85%氯胺磷可溶性粉劑以1∶4復(fù)配增效系數(shù)2.26[37]。由此可見(jiàn)，盡管目前已經(jīng)有多種藥劑的復(fù)配物對(duì)水稻紋枯病菌有明顯抑制效果，但其增效系數(shù)均低于啶酰菌胺和氟啶胺的復(fù)配物，所以啶酰菌胺與氟啶胺復(fù)配具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為新型農(nóng)藥的潛力。啶酰菌胺和氟啶胺的復(fù)配物對(duì)抑制草莓灰霉病菌的最高增效系數(shù)為1.30（EC50為0.286 3 μg/mL），抑制效果與嘧菌環(huán)胺和腐霉利按照1∶1和1∶2比例復(fù)配（EC50分別為0.062 mg/L和2.005 mg/L）和乙蒜素與苯醚甲環(huán)唑按照1∶2和2∶1復(fù)配（EC50分別為0.065 mg/L和0.833 mg/L）[16]不相上下，且抑制效果明顯優(yōu)于部分藥劑配比的效果。

啶酰菌胺和氟啶胺主要用于對(duì)葡萄孢屬等真菌病害的防治，本試驗(yàn)結(jié)果表明，啶酰菌胺和氟啶胺對(duì)水稻紋枯病菌也有很好的抑菌作用，兩者復(fù)配更是表現(xiàn)出了一定的增效作用，后期可以再探究這兩種藥劑對(duì)其他病原菌是否也具有明顯的抑制效果，從而擴(kuò)展兩種藥劑的應(yīng)用范圍。另外，啶酰菌胺和氟啶胺混配的增效機(jī)制、后期混配產(chǎn)品劑型的研制、產(chǎn)品的環(huán)境行為以及檢測(cè)方法等均有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）