我國部分地區(qū)梅樹病毒病的病原初步檢測

王程安 周俊 陳夢婷 崔西云 高蕊 肖紅 盧美光 張志想 李世訪

摘要 梅是一種原產(chǎn)于中國、具有重要經(jīng)濟(jì)價值、花果兼用型的樹種。在其生長繁育過程中易受病毒等病原侵染，從而可能造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前我國梅樹上病毒的發(fā)生及分布尚不清楚。為此，對無錫、武漢、上海、杭州、南京的梅園進(jìn)行了調(diào)查，采集了115份樣品，其中發(fā)現(xiàn)了疑似病毒病害，主要癥狀表現(xiàn)為花葉、卷葉、葉片皺縮、褪綠、脈間失綠等。RT-PCR檢測出了蘋果莖溝病毒（ASGV）、櫻桃病毒A（CVA）和亞洲李屬病毒2（APV 2），檢出率分別為30.4%、4.3%和3.5%。此外，克隆了這三種病毒的外殼蛋白基因序列，同GenBank已登錄的相應(yīng)序列相似性為86%～99% （核苷酸水平）和83%～99%（氨基酸水平）。序列比較發(fā)現(xiàn)APV2梅分離物與日本梅分離物親緣關(guān)系較近。

關(guān)鍵詞 梅； 病毒； 蘋果莖溝病毒； 櫻桃病毒A； 亞洲李屬病毒2

中圖分類號： S 436.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017294

Abstract Japanese apricot （Prunus mume） is an economically important fruit and ornamental plant， which originated in China. It is susceptible to different viruses. Viral infection may cause some severe diseases， resulting in significant economic losses. However， viruses infecting Japanese apricot in China are still unknown. Here， we carried out a large-scale survey of virus diseases of Japanese apricot in Wuxi， Wuhan， Shanghai， Hangzhou， and Nanjing in China. Suspected virus diseases were found in almost all Japanese apricot gardens. Symptoms mainly include leaf curl， vein clearing， and mosaic. A total of 115 leaf samples were collected in spring and early summer and were detected by RT-PCR using specific primers for Apple stem grooving virus （ASGV） ，Cherry virus A （CVA）， and Asian Prunus virus 1， 2， 3 （APV1， APV2， APV3）. The results showed that ASGV， CVA， and APV2 were positive with infection rate of 30.4%， 4.3%， and 3.5%， respectively. The amplified products were sequenced to verify the three viruses. The obtained sequences of ASGV， CVA， and APV2 shared 86%-99% nucleotide identity and 83%-99% amino acid identity with those deposited in GenBank. It was the first report of ASGV and APV2 in Japanese apricot in China. Furthermore， phylogenetic analysis showed that the isolated APV2 was closest to those isolated from Japan.Since the exchange of Japanese apricot propagation materials is frequent between China and Japan， APV2 may be transmitted through propagation materials between the two countries. The presence of ASGV， CVA， and APV2 means a potential threat to Japanese apricot industry. More attentions should be paid to virus diseases in Japanese apricot in China， and some actions should be taken to control the diseases.

Key words Japanese apricot （Prunus mume）； viruses； Apple stem grooving virus； Cherry virus A； Asian Prunus virus 2

梅Prunus mume Sieb. et Zucc.原產(chǎn)于中國，已有三千多年的栽培歷史，為花果兼用型樹種，具有較為重要的經(jīng)濟(jì)價值。梅廣泛栽培于全國各地，尤以長江流域及西南地區(qū)為盛[1]。中國不僅有豐富的梅品種資源，是野生種質(zhì)和栽培品種最多的國家，而且是重要的梅產(chǎn)區(qū)[2]。此外，我國作為花梅的研究中心，目前已圍繞武漢、無錫、南京等地建立了梅花品種收集網(wǎng)絡(luò)[3]。

梅在生長繁育過程中易受多種病毒侵染，主要有蘋果莖溝病毒Apple stem grooving virus （ASGV）、櫻桃病毒A Cherry virus A（CVA）、亞洲李屬病毒Asian prunus virus 1， 2， 3（APV1， APV2， APV3）[4]。目前已報道的侵染梅的病毒大多發(fā)生在中國和日本。1990年Takahashi等[5]在日本的梅上檢測到了ASGV，值得指出的是，該梅是1985年由中國出口到日本的。Marais等[6]利用RT-PCR技術(shù)在我國江蘇的梅上檢出了CVA，其分離物序列與杏分離物、歐洲李分離物、梅分離物以及櫻桃分離物序列的相似性均在90%以上。

APV最早由Hadidi等[7]在亞洲的李屬種質(zhì)資源上發(fā)現(xiàn)并命名為李屬潛隱病毒Asian prunus latent virus （APLV）。Marais等基于基因組結(jié)構(gòu)及序列分析認(rèn)為APV屬于乙型線性病毒科Betaflexiviridae中的凹陷病毒屬Foveavirus，并將其獲得的APV分別命名為APV1、APV2、APV3，并從日本的梅上檢出了APV1和APV2[89]。2016年Marais等[10]利用高通量測序技術(shù)再次從日本的梅上檢出了APV1、APV2 ，并獲得了APV1與APV2梅分離物的基因組全序列。目前，我國梅上病毒病害的發(fā)生和分布尚不清楚，而中國與日本之間梅種質(zhì)資源交流頻繁，病毒可能會通過繁殖材料進(jìn)行傳播。

已有研究表明ASGV、CVA與APV除侵染梅外，還可以侵染其他果樹。ASGV寄主范圍廣泛，主要危害蘋果、梨、柑橘、櫻桃等，在全國各地均有報道[11]。CVA主要侵染櫻桃、桃、杏等李屬植物，在環(huán)渤海灣地區(qū)、河南、云南、新疆等地均有檢出[1214]。目前國內(nèi)有關(guān)APV的報道極少，僅在江蘇的桃上檢出APV3[10]。除APV外，ASGV與CVA在我國的分布均較為廣泛。

為了明確我國梅樹上病毒病害的發(fā)生情況及相關(guān)病原，本研究開展了實地調(diào)查和RT-PCR檢測。初步掌握了主要的幾個梅園中疑似病毒病害的發(fā)生情況，并且明確了ASGV、CVA和APV2在我國梅樹上的發(fā)生。該結(jié)果為進(jìn)一步監(jiān)測和控制梅上ASGV、CVA和APV2的傳播和擴(kuò)散提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

2014-2015年，對無錫、武漢、上海、杭州以及南京梅園中病毒病害發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，采集有疑似病毒病害癥狀和無癥狀的梅花葉片共115份，記錄發(fā)病癥狀并采集癥狀照片（圖1）。

1.1.2 主要試劑和儀器

TRIzol RNA提取試劑、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen試劑公司；主要儀器包括 BIO-RAD My Cycler PCR儀、KCBIO-2800凝膠成像系統(tǒng)等。

1.1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中已登錄的相應(yīng)病毒CP基因序列設(shè)計ASGV、APV1、APV2、APV3的RT-PCR擴(kuò)增引物ASGV-CPu/d、APV1- CPu/d、APV2-CPu/d、APV3-CPu/d，并參考文獻(xiàn)選擇ASGV、CVA的RT-PCR擴(kuò)增引物ASGV-F/R、CVA-F/R（表1）。引物由北京六合華大科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

稱取新鮮葉片0.1 g，采用改良TRIzol法提取總RNA，具體步驟參照文獻(xiàn)[17]。

1.2.2 RT-PCR檢測

反轉(zhuǎn)錄體系：dNTPs （2.5 mmol /L） 1 μL，5×M-MLV buffer 2 μL，M-MLV （200 U/μL） 和隨機(jī)六聚引物0.5 μL，RNase inhibitor （40 U/μL） 0.25 μL，RNA模板1 μL，用無菌雙蒸水補(bǔ)足至10 μL，混勻，42℃水浴鍋中溫育1 h，直接進(jìn)行PCR或置于-20℃冰箱保存。

PCR檢測體系：2×Taq PCR Mastermix 10 μL，上下游引物各0.5 μL（20 μmol/L），反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，用無菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，Tm退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%～2% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，凝膠成像儀采集結(jié)果。

1.2.3 PCR產(chǎn)物克隆及測序

參照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明書回收純化PCR擴(kuò)增得到的目標(biāo)產(chǎn)物，分別連接至pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，抗性篩選，挑選單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，每種病毒每個樣品分別挑選2～4個陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.4 序列分析

用DNAMAN進(jìn)行比較分析，并用MEGA 6.0進(jìn)行相關(guān)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，采用相鄰法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以重復(fù)1 000次的自展值來判斷分支可靠性，忽略自展值小于75%的數(shù)值。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹所用到的各病毒分離物信息（基因登錄號、分離物名稱、寄主、來源地及其參考文獻(xiàn)）見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 梅病毒病害初步調(diào)查

調(diào)查發(fā)現(xiàn)武漢、無錫、上海以及南京等地的梅園中均有疑似病毒病的發(fā)生，主要癥狀表現(xiàn)為花葉、葉片皺縮、卷葉、褪綠、脈間失綠等（圖1）。其中，南京梅園發(fā)病率最高，幾乎每棵樹都有疑似病毒病的癥狀，主要表現(xiàn)為環(huán)斑、葉脈褪綠。其次是武漢梅園，發(fā)病率達(dá)50%。該梅園中不同樹齡植株上的癥狀表現(xiàn)不同。兩三年生植株上花葉較為嚴(yán)重，甚至整株表現(xiàn)花葉，三年生以上的植株未發(fā)現(xiàn)疑似病毒病的癥狀，但落果較為嚴(yán)重。上述結(jié)果表明我國部分地區(qū)梅園中疑似病毒病的發(fā)生較為普遍與嚴(yán)重，有必要進(jìn)行相關(guān)病毒的檢測及鑒定。

2.2 梅主要病毒的RT-PCR檢測

使用RT-PCR檢測采集的115份梅樹葉片上的5種主要病毒ASGV、CVA、APV1、APV 2、APV3，結(jié)果僅檢出ASGV、CVA、APV2（圖2），未檢出APV1和APV3。ASGV的檢出率最高，達(dá)30.4%； CVA和APV2的檢出率分別為4.3% 與3.5%（表3）。其中，無錫梅園中ASGV、CVA和APV2的檢出率分別為56.7%、13.3%與6.7%。武漢梅園中ASGV檢出率最高，達(dá)77.8%；CVA檢出率為5.5%，未檢出APV2。上海梅園中ASGV和APV2的檢出率分別為18.8%與6.3%。杭州梅園中ASGV與APV2的檢出率均為14.3%。南京梅園中未檢出這5種病毒（表3）。此外，無錫梅園（2個樣品）和武漢梅園（1個樣品）的樣品存在ASGV與CVA的混合侵染，杭州梅園發(fā)現(xiàn)1個樣品存在ASGV與APV2的混合侵染。結(jié)合實地調(diào)查和RT-PCR檢測結(jié)果，說明梅病毒病在我國普遍發(fā)生、分布廣泛，且存在不同病毒混合侵染的現(xiàn)象。

2.3 序列測定及比較分析

將ASGV-CP、CVA-F/R、APV2-CP擴(kuò)增所得外殼蛋白（coat protein， CP）基因進(jìn)行純化、克隆和測序。其中獲得ASGV與CVA的CP基因全長序列各4條，APV2的CP基因全長序列8條，不同樣品間ASGV、CVA與APV2的序列相似性分別為99.86%、99.92%與97.26%。并將本研究所得序列與GenBank中相關(guān)病毒的核苷酸序列及氨基酸序列進(jìn)行對比。結(jié)果顯示，獲得的序列與相應(yīng)參考序列在核苷酸水平上的相似性為86%～99%，在氨基酸水平上的相似性為83%～99%，說明成功獲得了ASGV、CVA與APV2的CP基因序列。此外，ASGV、CVA、APV2每個陽性樣品的克隆序列之間相似性較高（相似性>98.0%），因此僅選取部分有代表性的序列登錄GenBank。ASGV、CVA、APV 2分別注冊1、1與4條序列，獲得登錄號為KY680265～KY680270。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

對ASGV、CVA、APV2的CP基因的核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，獲得的ASGV梅分離物HZ76（KY680265）與中國柑橘分離物（KC588948.1）的親緣關(guān)系最近（圖2a）。CVA梅分離物WX20（KY680266）與法國桃分離物PF（HQ267856.1）在同一分支上，而明顯區(qū)分于其他來自櫻桃的分離物，說明CVA WX20與PF親緣關(guān)系最近（圖2b）。獲得的3個APV2梅分離物WXGM（KY680267）、WX35（KY680268）、HZ78（KY680269）聚集在一起，與中國桃分離物TaTao25、日本桃分離物Bungo 2以及日本梅分離物Bungo處于同一分組，說明這些分離物之間親緣關(guān)系較近（圖2c）；而APV2梅分離物SH85（KY680270）與日本梅分離物Bonsai（KT893295.1）處于另一分組（圖2c），說明APV2 SH85與Bonsai親緣關(guān)系最近。

3 討論

本研究通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國部分地區(qū)梅園中疑似病毒病的發(fā)生較為普遍與嚴(yán)重，利用RT-PCR技術(shù)檢出了ASGV、CVA和APV2，病毒總檢出率達(dá)38.26%，說明我國已有相當(dāng)大的一部分梅感染了病毒。首次從國內(nèi)的梅上檢測到ASGV和APV2。在無錫、武漢和杭州梅園中均檢測到多種病毒復(fù)合侵染同一植株，這說明我國梅上病毒病的發(fā)生情況較為復(fù)雜，存在著多種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。此外ASGV檢出率較高，且在無錫、武漢、上海和杭州梅園中均有檢出，這應(yīng)當(dāng)引起必要的關(guān)注。南京樣品中未檢出這3種病毒。由于RT-PCR技術(shù)只能特異性檢測待檢病毒，推測南京樣品中可能存在其他病毒。因此，為進(jìn)一步明確梅上是否存在其他病毒，將來有必要利用高通量測序等技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步檢測和鑒定。

目前ASGV、CVA和APV2的侵染與癥狀之間的相關(guān)性尚不明確。由于ASGV、CVA、APV具有潛隱性[3234]，且本研究中存在多種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象，因此觀察到的癥狀與這3種病毒的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究確定，而且是否存在其他侵染梅的病毒仍需進(jìn)一步深入研究。有研究發(fā)現(xiàn)梅上的ASGV與APV2分離物能在木本指示植物上引起相應(yīng)癥狀。Takahashi等[5]將感染ASGV的梅的接芽嫁接到木本指示植物三葉海棠及弗吉尼亞小蘋果上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三葉海棠接種點周圍出現(xiàn)壞死，弗吉尼亞小蘋果植株上出現(xiàn)莖溝。APV2梅分離物Bonsai接種桃GF305后，引起老葉畸形[35]。CVA單獨侵染寄主后一般不表現(xiàn)癥狀，但與其他病毒復(fù)合侵染引起嚴(yán)重病害[33]。本研究發(fā)現(xiàn)ASGV與CVA復(fù)合侵染的植株比ASGV或CVA單獨一種侵染的植株癥狀表現(xiàn)嚴(yán)重，但觀察到的癥狀是否由ASGV、CVA單獨或復(fù)合侵染所致有待進(jìn)一步研究。

繁殖材料的交換是病毒傳播的重要途徑之一。本研究發(fā)現(xiàn)中國APV2梅分離物與日本APV2梅分離物Bonsai親緣關(guān)系最近。值得指出的是，中國與日本的梅品種資源數(shù)量相當(dāng)，兩國之間梅種質(zhì)資源交流頻繁，我國建立的梅花品種資源圃和全國果梅種質(zhì)圃中保存了日本引進(jìn)的梅品種[3638]。由此可推知，APV2可能通過繁殖材料的引用在中國與日本之間擴(kuò)散，并隨著種植規(guī)模的擴(kuò)大進(jìn)一步蔓延。本研究結(jié)果雖然為APV2在中國和日本間的流行傳播提供了線索，但仍缺乏直接證據(jù)的支持。

加強(qiáng)對我國梅的病毒病發(fā)生種類、分布和危害的調(diào)查，加強(qiáng)梅苗木在引種和調(diào)運過程中的病原檢疫檢測工作，對控制我國梅病毒傳播以及防治具有十分重要的意義。此外，中國作為梅的原產(chǎn)地，遺傳種質(zhì)資源豐富，有必要對不同梅品種對ASGV、CVA和APV2的抗性進(jìn)行研究，以期為抗病品種的培育提供可利用的資源。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳俊愉. 中國梅花的研究I. 梅之原產(chǎn)地與梅花栽培歷史[J]. 園藝學(xué)報， 1962， 1（1）： 6978.

[2] 汪敏， 陳瑞丹， 吳瓊， 等. 入世背景下的中國梅發(fā)展之路[J]. 2003， 25（S2）： 8992.

[3] 包滿珠， 陳俊愉. 梅的研究現(xiàn)狀及前景展望[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報， 1992， 14（S4）： 7482.

[4] HADIDI A， BARBA M， CANDRESSE T， et al. Virus and virus-like diseases of pome and stone fruits[M]. St Paul， MN， USA： APS Press， 2011.

[5] TAKAHASHI T， SAITO N， GOTO M， et al. Apple stem grooving virus isolated from Japanese apricot （Prunus mume） imported from China [J]. Research Bulletin of the Plant Protection Service， 1990， 26： 1521.

[6] MARAIS A， FAURE C， SVANELLA-DUMAS L， et al. First report of Cherry virus A in Prunus mume in China[J]. Plant Disease， 2008， 92（11）： 15891589.

[7] HADIDI A， LEVY L. Accurate identification of Plum pox potyvirus and its differentiation from Asian prunus latent potyvirus in Prunus germplasm [J].EPPO Bulletin，1994，24：633643.

[8] MARAIS A， SVANELLA-DUMAS L， FOISSAC X， et al. Asian prunus viruses： new related members of the family Flexiviridae in Prunus germplasm of Asian origin[J]. Virus Research， 2006， 120： 176183.

[9] MARINI D B， GIBSON P G， SCOTT S W. The complete nucleotide sequence of an isolate of Asian prunus virus 1 from peach [Prunus persica （L.） Batch][J]. Archives of Virology， 2009， 154（8）： 13751377.

[10]MARAIS A， FAURE C， CANDRESSE T. New insights into Asian prunus viruses in the light of NGS-based full genome sequencing [J]. PLoS ONE， 2016， 11（1）： e0146420.

[11]鄭銀英. 蘋果莖溝病毒和褪綠葉斑病毒分子變異研究[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2005.

[12]王文文，宗曉娟，王甲威，等.環(huán)渤海灣地區(qū)甜櫻桃小果病毒及櫻桃病毒A的鑒定與調(diào)查[J].植物保護(hù)，2013，39（2）：128133.

[13]劉聰利， 李明， 趙改榮，等. 河南甜櫻桃病毒病害調(diào)查及病原檢測[J]. 植物保護(hù)， 2016，42（4）：200204.

[14]周登攀， 郝小軍， 向本春. 新疆石河子地區(qū)設(shè)施櫻桃病毒病害調(diào)查及病原檢測[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 54（4）：715724.

[15]梁鵬博，張志想，劉斐，等.蘋果花葉病病原鑒定中遇到的問題及其可能的病原探究[J].果樹學(xué)報，2016，33（3）：332339.

[16]盧美光， 吳冰， 高蕊， 等. 我國部分地區(qū)櫻桃病毒病害初步調(diào)查和病原檢測[J]. 植物保護(hù)， 2015， 41（1）： 98103.

[17]張蔚. 辣椒中PMMoV的檢測及棗樹病毒的鑒定[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2016.

[18]CHEN Shanyi， YE Ting， HAO Lu， et al. Infection of apple by Apple stem grooving virus leads to extensive alterations in gene expression patterns but no disease symptoms[J]. PLoS ONE， 2014， 9（4）： e95239.

[19]YOSHIKAWA N， SASAKI E， KATO M， et al. The nucleotide sequence of apple stem grooving capillovirus genome[J]. Virology， 1992， 191（1）： 98105.

[20]ZHAO Lei， HAO Xingan， LIU Ping， et al. Complete sequence of an Apple stem grooving virus （ASGV） isolate from China [J]. Virus Genes， 2012， 45（3）：5969.

[21]DHIR S， WALIA Y， ZAIDI A A， et al. A simplified strategy for studying the etiology of viral diseases： Apple stem grooving virus as a case study [J]. Journal of Virological Methods， 2015， 213： 106110.

[22]LIEBENBERG A， MOURY B， SABATH N， et al. Molecular evolution of the genomic RNA of apple stem grooving capillovirus [J].Journal of Molecular Evolution，2012，75（3/4）：92101.

[23]SHIM H， MIN Y， HONG S， et al. Nucleotide sequences of a Korean isolate of Apple stem grooving virus associated with black necrotic leaf spot disease on pear （Pyrus pyrifolia）[J]. Molecules & Cells， 2004， 18（2）： 192199.

[24]TERAUCHI H， MAGOME H， YOSHIKAWA N， et al. Nucleotide sequence of the genome of apple stem grooving capillovirus isolate and construction of an infectious cDNA clone of the genome containing a cauliflower mosaic virus 35S RNA [J]. Annuals of the Phytopathological Society of Japan， 1997， 63： 432436.

[25]OHIRA K， NAMBA S， ROZANOV M， et al. Complete sequence of an infectious full-length cDNA clone of citrus tatter leaf capillovirus： comparative sequence analysis of capillovirus genomes[J]. Journal of General Virology， 1995， 76（9）： 23052309.

[26]TATINENI S， AFUNIAN M R， GOWDA S， et al. Characterization of the 5′-and 3′-terminal subgenomic RNAs produced by a capillovirus： evidence for a CP subgenomic RNA [J]. Virology， 2009， 385（2）： 521528.

[27]MARAIS A， SVANELLA-DUMAS L， BARONE M， et al. Development of a polyvalent RT-PCR detection assay covering the genetic diversity of cherry capillovirus A [J]. Plant Pathology， 2012， 61（1）： 195204.

[28]NOORANI M S， AWASTHI P， SINGH R M， et al. Complete nucleotide sequence of Cherry virus A （CVA） infecting sweet cherry in India [J]. Archives of Virology，2010，155（12）： 20792082.

[29]JELKMANN W. Cherry virus A： cDNA cloning of dsRNA， nucleotide sequence analysis and serology reveal a new plant capillovirus in sweet cherry [J]. Journal of General Virology， 1995， 76（8）： 20152024.

[30]WANG Jiawei， ZHAI Ying， LIU Weizhen， et al. Structure and genome organization of Cherry virus A （Capillovirus， Betaflexiviridae） from China using small RNA sequencing[J]. Genome Announcements， 2016， 4（3）： e0036416.

[31]MARAIS A， SVANELLA-DUMAS L， BARONE M， et al. Development of a polyvalent RT-PCR detection assay covering the genetic diversity of Cherry capillovirus A [J]. Plant Pathology， 2012， 61（1）： 195204.

[32]CHEN H， CHEN S， LI Y， et al. Phylogenetic analysis and recombination events in full genome sequences of Apple stem grooving virus [J]. Acta Virologica， 2013，58（4）：309316.

[33]陳立偉， 宗曉娟， 王文文， 等. 櫻桃病毒A外殼蛋白基因克隆及其原核表達(dá)[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2012， 28（13）： 195199.

[34]HARI V， ABDEL-GHAFFAR M H， LEVY L， et al. Asian prunus latent virus： an unusual potyvirus detected in germplasm from East Asia [J].Acta Horticulturae，1995，386：7885.

[35]DESVIGNES J C， BOYE R， CORNAGGIA D， et al. Virus diseases of fruit trees[M]. Centre Technique Interprofessionnel des Fruits et Legumes （CTIFL）， Paris， France， 1999.

[36]張毅. 日本垂枝梅花資源[J]. 世界農(nóng)業(yè)， 2011（10）： 9094.

[37]褚孟姬. 中國果樹志梅卷[M]. 北京： 中國林業(yè)出版社， 1999： 147.

[38]李慶衛(wèi). 川滇藏黔野梅種質(zhì)資源調(diào)查和梅花抗寒品種區(qū)域試驗的研究[D]. 北京： 北京林業(yè)大學(xué)， 2009.

（責(zé)任編輯：楊明麗）