咪鮮胺降解菌群的富集及降解特性研究

劉 霞，胡世珊，吳曉玉，王 飛*

(1.南昌理工學(xué)院新能源與環(huán)境工程學(xué)院，江西南昌330000；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045)

咪鮮胺(Prochloraz，1-N-丙基-N-[ 2-(2,4,6-三氯苯氧基)乙基]-氨基甲酰咪唑)是英國(guó)Boots公司于1974年首先合成的一種高效廣譜的咪唑類殺菌劑，在正常貯存條件及堿性條件下均比較穩(wěn)定，但對(duì)日光不穩(wěn)定[1]。咪鮮胺抑菌的機(jī)制為抑制麥角甾醇生物合成，對(duì)多種作物子囊菌和半知菌病害有顯著防效[2]。廣泛應(yīng)用于防治各種作物及林業(yè)的真菌病害[3-7]，也用于種子、苗木處理及水果貯存期的病害[8-9]。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)咪鮮胺進(jìn)行藥效試驗(yàn)證實(shí)咪鮮胺對(duì)Sclerotiniasclerotiorum引起的油菜菌核病[10]、Mycosphaerellamusicola引起的香蕉葉斑病[11]、Penicilliumdigitatum引起的柑橘采后霉腐[12]、Melampsoralini引起的亞麻銹病[13]等都有明顯功效，且用量較低。

自咪鮮胺開發(fā)應(yīng)用以來，國(guó)內(nèi)外就其殘留代謝與環(huán)境毒理方面進(jìn)行了深入的研究。長(zhǎng)期過量使用咪鮮胺后，殘留的藥物在植株、果實(shí)、土壤產(chǎn)生一定量的沉積，通過淋濾作用進(jìn)入水體后，對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境和人類健康都構(gòu)成較大威脅[14]。咪鮮胺在環(huán)境中的降解,首先是降解成單個(gè)或結(jié)合態(tài)的N-丙基-N[2-(2,4,6-三氯苯氧基) 乙基] 脲(BTS 44595) 和N-醛基-N-丙基-N[2-(2,4,6-三氯苯氧基) 乙基]脲(BTS 44596) 。BTS 44595 和BTS 55596 最后降解成2,4,6- 三氯苯酚[1,14]。而咪鮮胺降解的中間代謝產(chǎn)物2,4,6-三氯苯酚對(duì)蝌蚪的毒性遠(yuǎn)大于其它代謝產(chǎn)物[15]，同時(shí)，2,4,6-三氯苯酚還會(huì)干擾抗雄激素性的性別分化[16-17]。

咪鮮胺自身在環(huán)境中的代謝降解較緩慢，研究表明，微生物是土壤和水環(huán)境中的有害化合物的降解的主力。采用生物法修復(fù)咪鮮胺所造成的環(huán)境污染，以及清除果蔬、農(nóng)產(chǎn)品上的農(nóng)殘，具有條件溫和，成本低，效率高，無二次污染等優(yōu)勢(shì)。當(dāng)前對(duì)咪鮮胺降解的研究大多集中在自然降解過程，對(duì)微生物降解的途徑和分子機(jī)制的研究尚無報(bào)道。因此，分離篩選出能高效降解咪鮮胺的微生物資源，通過對(duì)其生物降解途徑中關(guān)鍵降解酶的解析，對(duì)咪鮮胺污染的修復(fù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽培養(yǎng)基MSM(g/L)：NaCl 1.0，K2HPO41.5，NH4NO31.0，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，去離子水1 000 mL；pH 7.0～7.2。121 ℃、滅菌20 min。LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0；pH 7.0～7.2；121 ℃，滅菌20 min。固體LB培養(yǎng)基：液體LB培養(yǎng)基中加入15.0 g瓊脂粉。

1.1.2 試劑 咪鮮胺原藥(>95%)，由正邦集團(tuán)江西分公司李強(qiáng)先生饋贈(zèng)，Tris、HCl、NaOH、二氯甲烷、酵母粉、蛋白胨、NaCl、K2HPO4、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、無水硫酸鈉均為分析純，購(gòu)至江西必優(yōu)科技有限公司。pMD19-T載體，Taq酶，T4 DNA ligase，限制酶等均購(gòu)于TaKaRa公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 咪鮮胺紫外吸收光譜掃描 用電子天平準(zhǔn)確稱取咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)品1 g，用適量的甲醇溶液溶解，25 ℃定容至100 mL，制得10 000 mg/L的儲(chǔ)備母液，備用。

取100 μL咪鮮胺母液，加入至20 mL無菌水，配制成濃度為50 mg/L的咪鮮胺溶液，以等體積二氯甲烷萃取，靜置分層后，取下層二氯甲烷溶液加入少量無水硫酸鈉去除殘留的水份；于200～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外光譜掃描，確定最高吸收峰值。

1.2.2 咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將咪鮮胺母液用無機(jī)鹽培養(yǎng)基稀釋成不同的濃度：10，20,30,40,50 mg/L，在最大吸收峰波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，以O(shè)D228為縱坐標(biāo)，以咪鮮胺濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 降解菌群的富集 從安義、南豐等柑桔園區(qū)長(zhǎng)期受咪鮮胺污染的地區(qū)采集土樣，取5 g接種到含有20 mg/L咪鮮胺的100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30 ℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d。每天檢測(cè)降解效果并于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定生物量，7 d后取第一代的富集液5 mL，轉(zhuǎn)接至含50 mg/L咪鮮胺的100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中；7 d后取第一代的富集液5 mL，轉(zhuǎn)接至含100 mg/L咪鮮胺的100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中共轉(zhuǎn)接三代[18]。

1.2.4 初始pH對(duì)富集液降解咪鮮胺的影響 在250 mL的三角瓶中分別裝入100 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，并且將無機(jī)鹽培養(yǎng)基的初始pH分別設(shè)置為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入50 mg/L的咪鮮胺，將第三代的富集液以5%的接種量接入無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30 ℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，每12 h取樣，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定咪鮮胺的殘留量，計(jì)算降解率。

降解率=(對(duì)照農(nóng)藥濃度-降解菌處理后農(nóng)藥濃度)/對(duì)照農(nóng)藥濃度×100%。

1.2.5 咪鮮胺初始濃度對(duì)富集液降解能力的影響 在250 mL的三角瓶中分別裝入100 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，加入初始咪鮮胺終質(zhì)量濃度為20，50，100，150，200 mg/L，將第三代的富集液按5%接種量接入無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30 ℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，每12 h取樣測(cè)定咪鮮胺的殘留量，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定降解效果。計(jì)算降解率，確定咪鮮胺初始濃度對(duì)菌株降解咪鮮胺的影響。

1.2.6 接種量對(duì)富集液降解能力的影響 在250 mL的三角瓶中分別裝入100 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，加入咪鮮胺終濃度50 mg/L，將第三代的富集液按0%、1%、2%、3%、5%接種量接入無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，每12 h取樣測(cè)定咪鮮胺的殘留量，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定降解效果。計(jì)算降解率，確定接種量對(duì)菌株降解咪鮮胺的影響[19]。

1.2.7 咪鮮胺降解富集液菌落結(jié)構(gòu)分析 高鹽沉淀法提取降解菌群總DNA，以咪鮮胺菌群總DNA為模板，利用16S rRNA基因的通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：2×GC Buffer 25 μL，dNTP Mixture 5 μL，Mg2+4 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，Taq酶0.5 μL加ddH2O 12.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；10 ℃降溫結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物于0.75%瓊脂糖凝膠回收純化后TA克隆至pMD19-T。以陽(yáng)性克隆為模板，以M13-47和RV-M引物擴(kuò)增pMD-19T載體上插入的16S rDNA片段。引物序列為：M13-47：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′；RV-M：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′。PCR產(chǎn)物純化后，采用限制酶RsaⅠ和HhaⅠ分別酶切16S rDNA[19]。酶切產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)兩種酶切產(chǎn)物電泳圖篩選出同型條帶，送相應(yīng)轉(zhuǎn)化子的LB培養(yǎng)物至杭州祥音生物技術(shù)有限公司測(cè)序，分析菌群結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 咪鮮胺紫外光譜掃描

將含有50 mg/L咪鮮胺的無機(jī)鹽培養(yǎng)基以二氯甲烷萃取，在200～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果見圖1。咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)品在228 nm處有一最大吸收峰。此外在279 nm和288 nm處也有兩個(gè)不明顯的小峰，確定228 nm為檢測(cè)咪鮮胺的波長(zhǎng)。

圖1 咪鮮胺紫外掃描圖譜Fig.1 UV spectrum scanning of prochloraz

配制質(zhì)量濃度分別為10，20，30，40，50 mg/L的咪鮮胺溶液，在228 nm處測(cè)定吸光度，以咪鮮胺濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D228為縱坐標(biāo)，繪制咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得線性方程為y=0.040x-0.372，R2=0.997，該方程可以滿足咪鮮胺檢測(cè)需要。

2.2 咪鮮胺降解微生物群落的富集馴化

土樣經(jīng)過傳代富集培養(yǎng)之后，取第3代的培養(yǎng)物，每天測(cè)定生物量，二氯甲烷萃取后進(jìn)行紫外掃描。計(jì)算不同時(shí)段咪鮮胺的降解率，繪制生物量-降解率的關(guān)系圖，見圖2。

從圖2可知，富集液在第7天時(shí)可將50 mg/L的咪鮮胺基本降解完全，隨著咪鮮胺的降解，生物量也逐漸提高，表明富集液中的微生物菌群可以咪鮮胺為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。

圖2 富集液降解咪鮮胺的效率與生物量變化曲線Fig.2 Degradation curve of prochloraz by the consortium M3

圖3 初始pH對(duì)富集液降解能力的影響Fig.3 Effect of pH on degradation of prochloraz by the consortium M3

2.3 初始pH值對(duì)富集液降解能力的影響

配制不同pH值的培養(yǎng)基，按1%接種量接種第3代富集液后，定時(shí)檢測(cè)咪鮮胺殘留量，繪制時(shí)間-殘留率圖，見圖3。

由圖3可以看出，富集液在pH 8.0時(shí)對(duì)咪鮮胺的降解最好，36 h的降解率就達(dá)到了50%，在pH 7.0～9.0內(nèi)均有降解效果，這說明富集液中的菌群可以在大多數(shù)偏堿性的環(huán)境中發(fā)揮降解作用。然而富集液在酸性條件下的降解率比較低，在pH5.0時(shí)5 d后的降解率只有不到10%，這有可能是在酸性條件下限制了降解菌株的生長(zhǎng)。

2.4 咪鮮胺初始濃度對(duì)富集液降解能力的影響

按1%接種量接種第3代富集液至初始濃度分別為20，50，100，150，200 mg/L咪鮮胺的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，定時(shí)取樣檢測(cè)咪鮮胺殘留量，結(jié)果見圖4。

咪鮮胺的初始濃度對(duì)富集液的降解率均有明顯的影響，如圖4所示，當(dāng)咪鮮胺初始濃度為50 mg/L時(shí)，6 d后殘留量?jī)H為15.84%；而當(dāng)咪鮮胺的初始濃度為200 mg/L時(shí)，其殘留量為88.82%，因此咪鮮胺的最適初始濃度20 mg/L。從圖中可以看出,富集液對(duì)較低濃度的咪鮮胺有較好的降解效果，當(dāng)咪鮮胺濃度超過100 mg/L時(shí)，富集液的降解效果顯著下降，這可能是由于過高濃度的咪鮮胺對(duì)富集液產(chǎn)生毒害作用，或者是降解過程中的中間代謝產(chǎn)物對(duì)微生物菌群有毒害作用而抑制其生長(zhǎng)，從而會(huì)影響富集液的降解能力。

圖4 咪鮮胺初始濃度對(duì)富集液降解效果的影響Fig.4 Effect of prochloraz concentration on degradation of prochloraz by the consortium M3

圖5 接種量對(duì)富集液降解能力的影響Fig.5 Effect of inoculums on degradation of FE prochloraz by the consortium M3

2.5 接種量對(duì)富集液降解能力的影響

分別以0%，1%，2%，3%，5%的接種量接種第3代的富集液至含50 mg/L咪鮮胺的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，每天取樣測(cè)定咪鮮胺殘留量，計(jì)算殘留率，繪制接種量-殘留率的分時(shí)降解曲線，結(jié)果見圖5。

如圖5所示，當(dāng)咪鮮胺初始濃度為50 mg/L時(shí)，富集液接種量為3%和5%時(shí)，5 d后殘留率幾乎達(dá)到了零，即使接種量較低即1%和2%時(shí)也能達(dá)到較好的降解效果，殘留率達(dá)到了20%左右。5%的接種量則可以在5 d內(nèi)降解效率達(dá)到90%以上，所以，接種量的高低與農(nóng)藥的降解效率有直接的關(guān)系，接種量越大，咪鮮胺的降解效率越高。該結(jié)果進(jìn)一步證明了該富集液對(duì)咪鮮胺有較強(qiáng)的降解能力。

2.6 咪鮮胺降解菌群菌種鑒定

以富集液總DNA為模板，擴(kuò)增16S rDNA后，構(gòu)建16S rDNA文庫(kù)，經(jīng)限制性酶切圖譜(RFLP分型)，將優(yōu)勢(shì)菌株16S rDNA測(cè)序，所測(cè)序列于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，以blastn程序進(jìn)行序列比對(duì)，得到咪鮮胺降解菌富集液中優(yōu)勢(shì)菌種如表1，經(jīng)分析鑒定，富集液中多為稀少菌種及未培養(yǎng)菌。

表1 咪鮮胺降解菌群富集液中優(yōu)勢(shì)菌種類

3 討論

咪鮮胺作為一種廣譜殺真菌劑，廣泛應(yīng)用于土傳真菌病害防治及果實(shí)保鮮等。其主要代謝產(chǎn)物2,4,6-三氯苯酚對(duì)搖蚊幼蟲、蚯蚓等均有危害[20]。在自然條件下，降解緩慢，但當(dāng)前對(duì)其生物降解的研究少見報(bào)道。Bock等[21]以2,4,6-三氯苯酚為唯一碳源，分離得到的菌株Aureobacteriumsp.C964可以降解2,4,6-三氯苯酚，但不能降解咪鮮胺。此外，菌株AlcaligeneseutrophusTCP，RalstoniaeutrophaJMP134也可降解2,4,6-三氯苯酚，但并未發(fā)現(xiàn)它們可以從頭降解咪鮮胺[22-23]。

由于三氯苯酚具有極強(qiáng)的水溶性，經(jīng)二氯甲烷萃取，紫外掃描檢測(cè)時(shí)，三氯苯酚存在于水相，因此對(duì)紫外掃描法檢測(cè)的干擾較小，本研究建立的紫外掃描方法可以快速對(duì)殘留的咪鮮胺進(jìn)行檢測(cè)[24-25]。

咪鮮胺等咪唑類化合物含有 1 個(gè)含氮雜環(huán)，其雜環(huán)上的氮原子可與甾醇 14α-脫甲基酶P450(CYP51)的血紅素-鐵活性中心以配位鍵結(jié)合，從而抑制酶的活性。CYP51 是麥角甾醇生物合成途徑中的關(guān)鍵性酶，一旦其活性受到抑制，會(huì)阻礙麥角甾醇的合成導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞死亡[26]。細(xì)菌細(xì)胞膜不含麥角甾醇，沒有咪唑類化合物作用的靶點(diǎn)，從而可以進(jìn)化出對(duì)該類化合物的降解途徑。在CupriavidusnecatorJMP134降解2,4,6-三氯苯酚的過程中，2,4,6-三氯苯酚降解的起始步驟為氧化脫氯，通過依賴于黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的2,4,6-三氯苯酚單加氧酶(TcpA)催化底物生成2,6-二氯對(duì)苯醌；隨后2,6-二氯對(duì)苯醌繼續(xù)在TcpA的作用再經(jīng)水解脫氯生成6-氯-2-羥基對(duì)苯醌；6-氯-2-羥基對(duì)苯醌在還原酶(TcpB)的作用下生成6-氯-偏苯三酚；6-氯-偏苯三酚經(jīng)氧化開環(huán)生成2-氯馬來酰醋酸，最終轉(zhuǎn)化為β-酮己二酸而進(jìn)入三羧酸循環(huán)[27]。

本文以長(zhǎng)期受咪鮮胺污染的土壤為材料，在以咪鮮胺為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行富集和馴化，獲得一組微生物菌群，該菌群可以在6 d內(nèi)將50 mg/L的咪鮮胺降解完全。富集液在培養(yǎng)基初始pH 7.0～9.0均有降解效果，在pH 5.0時(shí)5 d后的降解率只有不到10%，最適降解pH為8.0；當(dāng)咪鮮胺初始深度為20 mg/L時(shí)，降解完全只需要3 d，當(dāng)初始濃度為50 mg/L時(shí)，降解完全時(shí)間為6 d，當(dāng)初始濃度升高至100 mg/L以上時(shí)，降解緩慢；富集液的接種量對(duì)降解效果有顯著影響，當(dāng)接種量為5%時(shí)，5 d后降解效率達(dá)90%以上，接種量為1%時(shí)，5 d降解效率僅為80%。

通過構(gòu)建咪鮮胺降解菌群16S rDNA文庫(kù)對(duì)該菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該富集液具有豐富的菌種多樣性，從16S rDNA文庫(kù)中已知的優(yōu)勢(shì)菌株來看，Sphingobacterium，Pseudomonas以及Methylobacterium菌屬大多具有污染物降解能力[19,28-30]，這些菌株可能參與了咪酰胺的生物降解進(jìn)程，但需要單菌降解實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。