上海地區(qū)草莓枯萎病病菌的鑒定及對4類殺菌劑的敏感性

許媛 成瑋 顏偉中 肖婷 王建華 吉沐祥 楊敬輝

摘要：為闡明上海地區(qū)草莓枯萎病病原菌分類地位及對藥劑的敏感性。運(yùn)用真菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分類方法，對上海地區(qū)不同草莓種植區(qū)分離得到的34株病原菌進(jìn)行鑒定，并采用菌絲生長速率法測定了病原菌群體對4種不同作用機(jī)制殺菌劑的敏感性。結(jié)果表明，34株病原菌均鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），病原菌群體對多菌靈、咪鮮胺、戊唑醇和吡唑醚菌酯的抑制中濃度（EC50）范圍分別為0.302 7～0.556 2、0.001 1～0.148 2、0.036 1～0.299 7、0.036 8～1.721 6 mg/L。病原菌群體對多菌靈和戊唑醇的EC50比值分別為1.8、8.3，而對咪鮮胺和吡唑醚菌酯的EC50比值分別達(dá)134.7、46.8。上海市域范圍內(nèi)不同地區(qū)間的尖孢鐮刀菌對同種殺菌劑的敏感性之間無顯著性差異，對4類不同作用機(jī)制殺菌劑之間的敏感性也無顯著相關(guān)性（P>0.05）。本研究結(jié)果明確了上海地區(qū)草莓枯萎病病原菌的分類地位，可以為合理選用殺菌劑防治病害及病原菌抗藥監(jiān)測提供參考。

關(guān)鍵詞：草莓枯萎病病菌;病原菌鑒定;多菌靈;戊唑醇;咪鮮胺;吡唑醚菌酯;敏感性

中圖分類號： S436.68+ 4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0115-06

收稿日期：2018-12-26

基金項(xiàng)目：江蘇省第五期“333”工程培養(yǎng)基金（編號：BRA2017149）;上海市農(nóng)業(yè)委員會(huì)示范推廣計(jì)劃[編號：滬農(nóng)推字（2015）第2-7號];江蘇省農(nóng)業(yè)工程[編號：SXGC（2017）214]。

作者簡介：許?媛（1991—），女，江蘇興化人，碩士，助理研究員，主要從事植病生防和化保方面的研究。Tel：（0511）80978081;E-mail：xyyuan007@163.com。

通信作者：楊敬輝，博士，研究員，主要從事農(nóng)作物病害防控方面的研究。Tel：（0511）80978081;E-mail：yjhnn32@126.com。

上海地區(qū)草莓種植面積約為2 000 hm2，主要分布在嘉定、青浦、金山和浦東等地區(qū)。近幾年，在上海地區(qū)部分大棚草莓移栽初期土傳病害危害嚴(yán)重，尤其以枯（黃）萎病為盛。發(fā)病植株地上部分新生心葉呈黃綠色、不對稱，呈大小葉狀，地下根呈黑褐色，嚴(yán)重時(shí)整株枯死，對大棚草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了極大的影響。由于該病田間危害癥狀與黃萎病極其相似，僅從田間表現(xiàn)形態(tài)上難以準(zhǔn)確區(qū)分。因此，本研究對從上海地區(qū)草莓主產(chǎn)區(qū)顯枯（黃）癥草莓植株上分離得到病原菌群體進(jìn)行鑒定，并檢測病原菌群體對4種不同作用機(jī)制殺菌劑的敏感性，旨在為探明上海地區(qū)草莓枯萎病病原菌群體的分類地位，明確病原菌群體對不同作用機(jī)制殺菌劑的敏感性現(xiàn)狀，以及為科學(xué)防控和抗藥性監(jiān)測提供參考。

1?材料與方法

1.1?供試培養(yǎng)基

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，簡稱PDA），用于病原菌的分離、保存、鑒定和藥劑敏感性測定。

1.2?菌株采集與分離

于2016年9月草莓移栽初期，從上海市嘉定區(qū)、青浦區(qū)和金山區(qū)大棚草莓園內(nèi)采集初發(fā)病癥的新鮮草莓根部組織，洗凈并用乙醇表面消毒后，采用常規(guī)的組織分離方法[1]，每個(gè)大棚分離3～5株，經(jīng)單孢純化后共得到34株菌株，將各菌株編號并保存于PDA斜面上，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3?供試藥劑

97.09%多菌靈原藥，由上海升聯(lián)化工有限公司提供;95.2%咪鮮胺，由江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司提供;95%戊唑醇，由江蘇鹽城利民農(nóng)化有限公司提供;95%吡唑醚菌酯，由德國巴斯夫股份（中國）有限公司提供。多菌靈用0.1 mol/L鹽酸溶解，其余原藥均用丙酮溶解，各藥劑均配制成10 000 mg/L的母液。99%水楊肟酸（salicylhydroxamic acid，簡稱SHAM），購自Sigma-Aldrich公司，用甲醇配制成20 000 mg/L 的母液。所有母液均置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4?病原菌形態(tài)觀察

將經(jīng)單孢分離得到的菌株移置于PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，并觀察其菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地等特征。

1.5?病原菌的致病性測定

1.5.1?病原菌分生孢子液的制備

沿病原菌（25 ℃、PDA上培養(yǎng)5 d）邊緣打取直徑為4 mm的菌餅，每個(gè)菌株分別挑取4塊菌餅置于裝有80 mL 馬鈴薯液體培養(yǎng)液的體積為250 mL的三角瓶中，每個(gè)病原菌接種1個(gè)三角瓶，置于25 ℃、120 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)液經(jīng)雙層無菌紗布過濾后，于顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用無菌水稀釋菌液分生孢子濃度至1×105～3×105個(gè)/mL，每個(gè)病原菌保留100 mL稀釋好的孢子懸浮液，置于4 ℃冰箱備用。

1.5.2?病原菌的接種方法

取紅頰草莓幼苗，洗凈根部，將苗浸于上述（“1.5.1”節(jié)）孢子液中30 s 后移栽于裝有滅菌基質(zhì)與田土混合（體積比為2 ∶8）的草莓苗缽中，每個(gè)菌株接種3株草莓苗，以無菌水浸根草莓苗作對照，苗缽置于草莓大棚內(nèi)培養(yǎng)，21 d后調(diào)查發(fā)病情況。取樣接種發(fā)病的草莓根部組織，參照柯赫氏法則進(jìn)行病原菌的再分離。

1.6?rDNA-ITS基因部分序列的測定

1.6.1?基因組DNA的提取

在PDA平板上新鮮生長的分離菌邊緣處打取直徑為4 mm的菌塊，接種于置有滅菌玻璃紙的PDA平板上，25 ℃暗培養(yǎng)72 h。將玻璃紙上的新鮮菌絲刮下置于1.5 mL離心管中，于65 ℃烘箱中烘干，用鑷子搗碎備用。真菌基因組的提取參照OMEGA真菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6.2?PCR擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析

rDNA-ITS引物采用真菌rDNA-ITS序列的通用引物[2]：ITS1/ITS4（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），預(yù)期擴(kuò)增長度為570 bp。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性 40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min;取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行純化和測序。將所得序列用BLAST搜索軟件在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜索比對分析。

1.7?草莓枯萎病病菌對4種殺菌劑的敏感性測定

采用菌絲生長速率法[3]，將保留的供試菌種移植到PDA平板中，25 ℃活化96 h，然后在菌落邊緣用打孔器制取直徑為4 mm的菌塊，移到含系列梯度藥劑濃度PDA平板正中央。多菌靈系列濃度為0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mg/L;咪鮮胺系列濃度為0.005、0.010、0.020、0.040、0.080、0.160、0.320 mg/L;戊唑醇系列濃度為0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mg/L;吡唑醚菌酯系列濃度為：0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000 mg/L，吡唑醚菌酯測定時(shí)所有平板中都含100 mg/L SHAM。采用無菌水作對照，每個(gè)處理重復(fù)3次。25 ℃培養(yǎng)72 h后用十字交叉法測量各處理的菌落直徑（cm），計(jì)算各處理的菌落直徑平均值，并按照下列公式計(jì)算菌絲生長平均抑制率：菌絲生長平均抑制率=[（對照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值）/（對照菌落直徑均值-接種菌餅直徑）]×100%。利用DPS軟件，通過濃度對數(shù)值（x）與抑制率概率值（y）之間的線性回歸關(guān)系，求出毒力回歸方程和有效抑制中濃度（EC50）。

2?結(jié)果與分析

2.1?病害癥狀及病原菌培養(yǎng)性狀觀察

發(fā)病草莓植株地上部分復(fù)葉呈黃綠色、卷曲，呈現(xiàn)大小葉狀，葉緣變褐、萎蔫至枯死;地下部分呈黑褐色，維管束變褐。采用組織分離法，從上海市嘉定區(qū)、青浦區(qū)、金山區(qū)的不同草莓大棚的草莓病株根頸內(nèi)組織上共分離純化得到34株單孢菌株（表1）。分離株在PDA培養(yǎng)基上菌絲形態(tài)呈白色、質(zhì)密、絮狀（圖1）。

2.2?病原菌致病性測定

在人工接種草莓幼苗21 d后，地上部分新生心葉變黃、呈現(xiàn)大小葉，或葉緣變褐出現(xiàn)萎蔫癥狀，病情進(jìn)一步發(fā)展后植株死亡，剖開根頸可見內(nèi)部變褐，與田間觀察到的癥狀一致。從接種發(fā)病的草莓根頸內(nèi)分離得到的菌株與接種所用菌株的菌落形態(tài)相似。由此可見接種所用的菌株是引起草莓枯萎病的病原菌（圖2）。

2.3?rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增及序列測定

菌株rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果表明，所有菌株的擴(kuò)增條帶都清晰、明亮，大小均約為570 bp的片段?而且不見明顯的非特異性雜帶，符

合預(yù)期的擴(kuò)增結(jié)果。測序和同源性序列進(jìn)行比對分析結(jié)果表明，所有菌株均為尖把鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

2.4?草莓枯萎病病菌對4種殺菌劑的敏感性檢測

采用菌落生長直徑法測得多菌靈、咪鮮胺、戊唑醇和吡唑醚菌酯對34株草莓枯萎病病菌的EC50值分別為（0.449 4±0.077 7）、（0.025 5±0.031 6）、（0.122 7±0.059 1）、（0.467 5±0.415 9） mg/L。34株草莓枯萎病群體對多菌靈和戊唑醇的敏感性差異較小，最大和最小EC50比值分別為1.8、8.3;而對咪鮮胺和吡唑醚菌酯的敏感性差異較大，最大和最小EC50比值分別為134.7、46.8。

2.5?不同地理來源菌株對4種殺菌劑的敏感性差異

分別比較取自嘉定區(qū)、青浦區(qū)和金山區(qū)的草莓枯萎病菌對供試藥劑的敏感性差異。結(jié)果（圖3）表明，對多菌靈的敏感性表現(xiàn)為金山區(qū)>青浦區(qū)>嘉定區(qū)（圖3-A），對咪鮮胺、戊唑醇和吡唑醚菌酯的敏感性均表現(xiàn)為嘉定區(qū)>金山區(qū)>青浦區(qū);不同地區(qū)來源的草莓枯萎病病菌對同種殺菌劑的敏感性之間存在差異，但上述差異均未達(dá)顯著水平（P>0.05）。

2.6?草莓枯萎病病菌對4種殺菌劑敏感性的相關(guān)性

通過敏感性（EC50）線性回歸分析（圖4）得出，多菌靈與咪鮮胺、多菌靈與戊唑醇、多菌靈與吡唑醚菌酯、咪鮮胺與戊唑醇、咪鮮胺與吡唑醚菌酯及戊唑醇與吡唑醚菌酯的決定系數(shù)分別為0.004 6、0.011 4、0.063 1、0.200 9、0.046 8、0.007 6，在P=0.05水平上均不顯著，表明草莓枯萎病病菌對這4種不同作用機(jī)制的殺菌劑的敏感性之間均無顯著相關(guān)性。

3?結(jié)論與討論

植物病原菌的鑒定及對藥劑的室內(nèi)敏感性測定與篩選工作，是正確指導(dǎo)田間病害防治的前提。本研究首次系統(tǒng)分離了上海市主要草莓產(chǎn)區(qū)呈現(xiàn)草莓枯（黃）萎綜合癥樣株的病原菌種群，并采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，對病原菌進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果表明，所有分離菌株均屬尖孢鐮刀菌，其分類地位為半知菌亞門、瘤座菌科、鐮孢屬、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum），該結(jié)果與吳祥等的報(bào)道[4-7]相一致。

值得與同行探討的是，本研究取樣時(shí)間為草莓定植期初期，取樣病株為枯（黃）萎病綜合癥病株，即發(fā)病幼苗新生葉失綠變黃或彎曲畸形、復(fù)葉上的兩側(cè)小葉不對稱呈畸形（典型的大小葉）、葉色黃化的病株?而非萎蔫枯死的枯萎病癥株。組織分離均

用根頸內(nèi)部的褐色組織，所有分離菌株從菌落培養(yǎng)特征上可以初步判定為鐮孢霉屬（Fusarium spp.），沒有一個(gè)菌株的菌落形態(tài)類似輪枝孢屬（Verticillium spp.）。類似的，從江蘇省蘇南地區(qū)鎮(zhèn)江市、蘇州市和無錫市的顯枯（黃）復(fù)合癥病株上，也只分離得鐮孢霉屬致病真菌。為此，從上述病原菌分離鑒定結(jié)果似乎可以得出，蘇南和上海地區(qū)危害草莓根部顯枯（黃）萎病癥的病原菌，都是鐮孢霉屬真菌，而非輪枝孢屬真菌。

本研究檢測了上海市嘉定區(qū)、青浦區(qū)和金山區(qū)3個(gè)草莓主產(chǎn)區(qū)的草莓枯萎病病菌群體，對目前生產(chǎn)上常用的苯并咪唑類、咪唑類、甾醇脫甲基抑制劑類和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的敏感性。上海地區(qū)草莓枯萎病菌種群對多菌靈的EC50均值為0.449 4 mg/L，略小于顧春波等報(bào)道的山東省草莓枯萎病病菌對多菌靈的敏感基線EC50均值（0.561 mg/L）[8]，而與陳宏州等報(bào)道的江蘇省草莓枯萎病病菌抗多菌靈菌株的EC50均值 （24.278 3 mg/L）[9]，和楊煥青等報(bào)道的山東省抗多菌靈的草莓枯萎病病菌菌株的EC50（49.490 0 mg/L）有極顯著性差異[10]。本研究中草莓枯萎病病菌種群間對多菌靈的最大與最小EC50的比值只有1.8（0.302 7～0.556 2 mg/L），且菌株敏感性頻率分布呈連續(xù)性單峰曲線，可以把EC50均值（0.449 4 mg/L）作為上海地區(qū)草莓枯萎病病種群抗藥性檢測的敏感基線。綜上分析，可以得出上海地區(qū)草莓枯萎病菌種群對多菌靈敏感。

裴龍飛等報(bào)道112株蔬菜尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）對咪鮮胺的平均EC50為0.030 1 mg/L，并將此值定為抗性檢測的敏感基線[11]。本研究取樣的34個(gè)菌株EC50均值（0.025 5 mg/L）小于報(bào)道的敏感基線值，但菌株間的最大和最小EC50比值達(dá)到134.7（0.001 1～0.148 2 mg/L），且菌株敏感性頻率呈不連續(xù)分布，因此種群中可能產(chǎn)生了敏感性下降的亞群體。本研究取樣菌群中只有6株菌株的EC50（0.040 6～0.148 2 mg/L）超過報(bào)道值，其余28株菌株中EC50值小于0.01 mg/L（0.0010～0.009 9 mg/L）的有13株菌株，有15株菌株的EC50在0.0100～0.029 8 mg/L之間?；谏鲜鲈?，在上海地區(qū)草莓枯萎病病菌對咪鮮胺的敏感基線EC50的確立時(shí)，應(yīng)取去除EC50陡然增高的2株菌株（16cf25和16cf04）后的EC50均值（0.018 8 mg/L）為抗藥性檢測的敏感基線較為適合，還需要從分子水平確定EC50陡然增高的2株菌株是抗性菌株，還是種群間的極端變異株菌株。

上海地區(qū)草莓枯萎病病菌取樣種群對戊唑醇的EC50均值為0.122 7 mg/L，低于顧春波等報(bào)道的山東省草莓枯萎病菌敏感菌株種群對戊唑醇的EC50（0.213 0、0.357 0、0.470 5 mg/L）[8，10，12]，近似于陳宏州報(bào)道江蘇省草莓枯萎病菌對戊唑醇的EC50（0.154 4 mg/L）[9]。本研究中草莓枯萎病病菌種群間對戊唑醇的最大與最小EC50比值為8.3（0.036 1～0.299 7 mg/L），且種群敏感性頻率分布呈連續(xù)性單峰曲線，可以把取樣種群EC50均值（0.122 7 mg/L）作為上海地區(qū)草莓枯萎病病菌對戊唑醇抗藥性檢測的基線，并指出上海地區(qū)草莓枯萎病病菌種群對戊唑醇敏感，沒有出現(xiàn)敏感性下降的亞群體。

文獻(xiàn)檢索表明，國內(nèi)外有關(guān)草莓枯萎病病菌對吡唑醚菌酯敏感基線的研究尚未見報(bào)道，本研究中取樣種群對吡唑醚菌酯的EC50均值為0.467 5 mg/L，種群間對吡唑醚菌酯的最大與最小EC50比值為46.78（0.036 8～1.721 6 mg/L）。取樣的34株菌株中有4株菌株的EC50陡增，超過1.0 mg/L。因此，在確定種群對吡唑醚菌酯的敏感性基線時(shí)，應(yīng)取去除EC50陡增的4株菌株后種群的EC50均值為宜，本研究中確定的草莓枯萎病病菌對吡唑醚菌酯的抗藥性檢測基線的EC50為0.334 7mg/L，僅供參考。取樣種群病菌對吡唑醚菌酯的敏感性頻率呈不連續(xù)分布，說明上海地區(qū)草莓枯萎病對吡唑醚菌酯可能產(chǎn)生了敏感性下降的亞種群。我們還需要從分子水平上確定EC50陡增的4株菌株是抗性菌株，還是極端變異菌株。

草莓枯萎菌是土壤傳播病害，病原菌抗藥性在跨區(qū)域間流行傳播的可能性較小。本研究表明，不同地區(qū)間枯萎病病菌種群對同一藥劑的敏感性間有天然異質(zhì)性差異（除試驗(yàn)操作外）的可能性，但相鄰地區(qū)來源的草莓枯萎病病菌對同種殺菌劑的敏感性之間沒有顯著性差異（P>0.05）。因此，有必要研究上海地區(qū)草莓枯萎病病菌種群對藥劑的敏感性，便于與其他省份的報(bào)道相對比。本研究中確定的上海地區(qū)草莓枯萎病病菌種群對多菌靈、咪鮮胺和戊唑醇的敏感基線值都小于其他省份的報(bào)道值，說明不能通過直接參考其他省份的數(shù)據(jù)，來當(dāng)作上海地區(qū)草莓枯萎病病菌種群對藥劑的敏感性基線。

在本研究中，雖然取樣菌株不是未接觸過藥劑的野生菌株，但鑒于上海地區(qū)還未有草莓枯萎病病菌種群對苯并咪唑類、咪唑類、甾醇脫甲基抑制劑類和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的敏感性研究。因此，可以把本研究中草莓枯萎病病菌種群的平均EC50（有些去除陡增大的值）作為抗藥性檢測的敏感基線。需指出的是，由于任何敏感基線的建立都是各自實(shí)驗(yàn)室特有的，因此，本研究中建立的敏感基線值僅供同行研究時(shí)參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1979：124-125.

[2]White T J，Bruns T，Lee S，et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[J]. PCR Protocols，1990，38：315-322.

[3]Chen L，Zhu S，Lu X，et al. Assessing the risk that Phytophthora melonis can develop a point mutation （V1109L） in CesA3 conferring resistance to carboxylic acid amide fungicides[J]. PLoS One，2012，7（7）：e42069.

[4]吳?祥，姚克兵，吉沐祥，等. 句容地區(qū)草莓枯萎病病原菌的分離鑒定及田間防治[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31（4）：764-770.

[5]伊海靜，陳?艷，劉正坪，等. 草莓枯萎病菌的分離鑒定及防治藥劑篩選[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，25（4）：626-635.

[6]于紅梅，趙密珍，王?靜，等. 草莓枯萎病菌的分離、鑒定及生物學(xué)特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（11）：124-127.

[7]王振華，張建坤，龔國祥，等. 草莓枯萎病菌的分離與鑒定[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（14）：3297-3299.

[8]顧春波，史曉斌，姜莉莉，等. 草莓枯萎病菌對多菌靈的抗性及其抗性菌株生物學(xué)特性[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2010，37（3）：266-272.

[9]陳宏州，莊義慶，楊敬輝. 黃麻鏈霉菌NF0919菌株對草莓枯萎病的生防活性初探[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，26（11）：54-57.

[10]楊煥青，王開運(yùn)，范?昆，等. 草莓枯萎病菌的生物學(xué)特性及7種殺菌劑對其抑制作用[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2008，35（2）：169-174.

[11]裴龍飛，朱發(fā)娣，柴阿麗，等. 中國華北地區(qū)瓜類尖孢鐮刀菌對咪鮮胺的敏感性及抗藥突變株生物學(xué)性狀研究[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2016，18（5）：575-581.

[12]林才華，王開運(yùn)，顧春波，等. 山東省草莓枯萎病菌對四種三唑類殺菌劑的敏感性檢測[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2009，36（1）：55-60.