類雌激素農(nóng)藥咪鮮胺對(duì)哺乳動(dòng)物的生殖毒理研究進(jìn)展

唐濤　周威　晏姣　戴清香　譚顯勝　金晨鐘　胡軍和

摘要 目前，類雌激素農(nóng)藥對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人口健康造成的危害日益受到人們的關(guān)注。類雌激素農(nóng)藥會(huì)影響雌性哺乳動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致生殖和發(fā)育方面的畸形。本文就類雌激素農(nóng)藥的概念及其對(duì)雌性哺乳動(dòng)物的毒性作用，并著重從咪鮮胺的類雌激素作用機(jī)制、檢測(cè)方法和今后研究趨勢(shì)3個(gè)方面進(jìn)行闡述，以期對(duì)于同行研究類雌激素農(nóng)藥對(duì)哺乳動(dòng)物生殖毒理方面的研究有一定借鑒意義。

關(guān)鍵詞 類雌激素農(nóng)藥;咪鮮胺;哺乳動(dòng)物;生殖毒理

中圖分類號(hào) S481.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-5739（2019）08-0223-03

農(nóng)藥是廣泛應(yīng)用于害蟲(chóng)和病害控制的主要化學(xué)品，僅就農(nóng)業(yè)用途而言，歐盟每年使用殺蟲(chóng)劑超過(guò)14萬(wàn)t，大量應(yīng)用殺蟲(chóng)劑會(huì)引起人們對(duì)農(nóng)藥危害人類健康的擔(dān)憂，如生殖安全的擔(dān)心，包括目前人類不孕發(fā)病率的逐年，上升也與之相關(guān)。為了提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率，農(nóng)藥被人們長(zhǎng)期和大量使用”，對(duì)環(huán)境造成十分嚴(yán)重的污染，特別是有些農(nóng)藥中含有類似雌激素的成分，可能影響動(dòng)物甚至人的內(nèi)分泌功能。

咪鮮胺是一種新型咪唑類高效廣譜殺菌劑2，通用名為Prochloraz，又叫卜菌唑、撲霉唑，具有觸殺性和內(nèi)吸性，通過(guò)抑制麥角幽醇的生物合成，從而破壞菌體細(xì)胞膜功能而起作用”。研究表明，咪鮮胺在體外引發(fā)多種作用機(jī)制，因?yàn)樗卓剐奂に睾痛萍に厥荏w，并抑制芳香酶活性。總之咪鮮胺是一種類雌激素農(nóng)藥，其有關(guān)的干擾內(nèi)分泌作用機(jī)制、檢測(cè)技術(shù)和今后研究方向方面的論述還不是很系統(tǒng)。因此，本文就咪鮮胺對(duì)于哺乳動(dòng)物生殖毒理方面的研究予以綜述，期望對(duì)該領(lǐng)域今后的研究有一定的意義。

1咪鮮胺的類雌激素作用機(jī)制的研究

類雌激素農(nóng)藥咪鮮胺也是一種內(nèi)分泌干擾物（endocrinedisruptingchemicals，EDCs），能夠干擾正常內(nèi)分泌激素生物合成4。許多EDCs具有類似雌激素活性并干擾由雌激素受體（estrogenreceptors，ER）介導(dǎo)的正常雌激素信號(hào)傳導(dǎo)作用5。EDCs可以通過(guò)與ER直接作用，間接通過(guò)芳香烴受體等轉(zhuǎn)錄因子或通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)正常雌激素合成和代謝至關(guān)重要的代謝酶，來(lái)調(diào)節(jié)和修飾基因組和非基因組ER的活性，從而影響雌激素的功能。雖然受體結(jié)合內(nèi)源性雌激素17β一雌二二醇（Estrogen2，E2），具有相似的親和力，但許多外源性配體已顯示出對(duì)ER的選擇性間。通常，EDCs通過(guò)多種機(jī)制起作用，包括通過(guò)激活其他轉(zhuǎn)錄因子，最顯著的是芳香烴受體的間接作用，或通過(guò)雌激素代謝的修飾。具有上述類似雌激素功能，并且干擾正常內(nèi)分泌功能的農(nóng)藥稱之為類雌激素農(nóng)藥，目前使用比較廣泛67。

某些類雌激素農(nóng)藥與激素有類似的化學(xué)構(gòu)象，可以和激素受體直接結(jié)合，形成配體受體復(fù)合物，復(fù)合物再結(jié)合到細(xì)胞核DNA結(jié)合域的雌激素反應(yīng)元件上，誘導(dǎo)或抑制有關(guān)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的靶基因的轉(zhuǎn)錄8。而某些物質(zhì)可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合雄激素受體，雖然二者結(jié)合后無(wú)生理活性，但由于該類物質(zhì)占據(jù)了正常激素的結(jié)合位點(diǎn)，使之無(wú)法與受體結(jié)合從而減弱了正常的激素效應(yīng)四。咪鮮胺是羊毛甾醇14a一脫甲基酶（lanosterol14a-demethylase或CYP51A1）的抑制劑，它是從羊毛甾醇中生產(chǎn)麥角甾醇（真菌細(xì)胞膜的必需成分）所必需的，而羊毛甾醇14x一脫甲基酶是一種細(xì)胞色素P450酶，參與羊毛甾醇轉(zhuǎn)化為4，4-二甲基膽甾醇-8（9），14，24-三烯-3B-醇。

咪鮮胺有較弱的抗雄激素活性，能夠拮抗外周雄激素受體，減緩雄激素依賴性組織的生長(zhǎng)發(fā)育;還能夠拮抗中樞雄激素受體，阻斷睪酮負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，引起腦垂體促黃體生成素分泌增多叫。類雌激素農(nóng)藥對(duì)男性的影響尤為突出，表現(xiàn)為性腺發(fā)育不良、生殖道腫瘤和先天畸形增多。

因此，咪鮮胺也是一種新型內(nèi)分泌干擾物，主要拮抗相關(guān)生殖激素受體發(fā)揮作用，因?yàn)樗l(fā)雙重作用機(jī)制并且通過(guò)阻斷雄激素受體和抑制胎兒類固醇生成起到抗雄激素的作用。體內(nèi)咪鮮胺通過(guò)降低生殖器官的重量，影響前列腺中雄激素調(diào)節(jié)的基因表達(dá)和增加促黃體激素水平素。

2農(nóng)藥咪鮮胺類雌激素作用的檢測(cè)方法

2.1整體動(dòng)物試驗(yàn)

一般整體動(dòng)物試驗(yàn)是通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)研究相關(guān)農(nóng)藥受試物對(duì)哺乳動(dòng)物生殖功能和發(fā)育過(guò)程的影響，預(yù)測(cè)其可能產(chǎn)生的對(duì)生殖細(xì)胞、受孕等的不良影響。對(duì)于雌性動(dòng)物的測(cè)試，較經(jīng)典的方法有子宮增重試驗(yàn)1和陰道細(xì)胞角化試驗(yàn);此外，還有過(guò)氧化物酶活力測(cè)定8及子宮血管滲透性試驗(yàn)凹。體內(nèi)試驗(yàn)的關(guān)鍵在于選擇合適的試驗(yàn)動(dòng)物和易于檢測(cè)的生理指標(biāo)。如魚(yú)類卵黃蛋白原誘導(dǎo)試驗(yàn)，就是根據(jù)正常雄性體內(nèi)不會(huì)含有卵黃蛋白原，在大劑量人工雌激素作用下以及在低劑量類雌激素長(zhǎng)期作用下，都能誘導(dǎo)體內(nèi)卵黃蛋白原的生成，從而檢測(cè)經(jīng)類雌激素農(nóng)藥作用后的雄魚(yú)體內(nèi)的卵黃蛋白原的含量來(lái)評(píng)價(jià)其毒性。有研究者提出一套將日本青鏘胚胎和幼魚(yú)暴露于排放污水中，通過(guò)對(duì)暴露后的胚胎損壞死亡情況、孵化率、孵化時(shí)間、幼魚(yú)畸形、平游失敗率、生長(zhǎng)（體重、體長(zhǎng)）、性別比率和死亡率等指標(biāo)進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)，從而評(píng)價(jià)排放污水的毒性和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的方法。

總之，雖然體內(nèi)試驗(yàn)法的結(jié)果可靠，但是要求大量的動(dòng)物毒理學(xué)試驗(yàn)，需要以犧牲大量的試驗(yàn)動(dòng)物為代價(jià)，并且花費(fèi)大量的人力物力，而且持續(xù)周期較長(zhǎng)。同時(shí)，不同種類的試驗(yàn)動(dòng)物，不同生長(zhǎng)階段的同一種試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)同一類雌激素農(nóng)藥均可能表現(xiàn)出不同的試驗(yàn)結(jié)果。因此，經(jīng)體內(nèi)試驗(yàn)法得出的結(jié)論也有一定的局限性。

2.2離體細(xì)胞試驗(yàn)方法

乳腺癌細(xì)胞7細(xì)胞（breastcancercells，MCF-7）來(lái)源于人乳腺癌細(xì)胞，其雌激素受體表達(dá)陽(yáng)性，具有雌激素依賴性，并在暴露于雌激素化學(xué)物質(zhì)后迅速增殖，廣泛應(yīng)用于類雌激素農(nóng)藥活性的評(píng)價(jià)2。因此，通過(guò)雌激素受體（ER）依賴性MCF-7細(xì)胞增殖試驗(yàn)可以檢測(cè)農(nóng)藥的雌激素活性2。具體的操作方法如下：將MCF-7細(xì)胞接種在含有細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中孵育24h后，用試驗(yàn)培養(yǎng)基（含有待檢測(cè)物質(zhì)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液）代替原有的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6d，然后統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)，從而研究其添加物對(duì)于MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。另外，還可以檢測(cè)其對(duì)照組和不同試驗(yàn)組培養(yǎng)液中雌激素水平的變化，最終決定其檢測(cè)物質(zhì)的抗雌激素作用強(qiáng)度。

另外，還有E-SCREEN方法，就是試驗(yàn)以利用雌激素對(duì)其靶細(xì)胞的增殖作用作為終點(diǎn)來(lái)評(píng)估環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的雌激素性，該定量測(cè)定法比較了在沒(méi)有雌激素（陰性對(duì)照）和存在17β-雌二醇（陽(yáng)性對(duì)照）和一系列懷疑是雌激素的化學(xué)物質(zhì)的情況下通過(guò)相似的MCF-7細(xì)胞接種物獲得的細(xì)胞數(shù)。目前，研究發(fā)現(xiàn)E-SCREEN測(cè)定法可以用來(lái)測(cè)量類雌激素農(nóng)藥對(duì)于生殖方面的影響。具體方法是，用一系列濃度的化學(xué)品或目的樣品處理后，使用E2作為陽(yáng)性對(duì)照，研究MCF7細(xì)胞的增殖情況。使用該測(cè)定法，發(fā)現(xiàn)多種化合物是雌激素的類似物，如烷基酚、鄰苯二.甲酸酯咪鮮胺等。進(jìn)一步研究顯示，這些化合物可以結(jié)合ER并激活MCF7細(xì)胞中pS2（一種雌激素應(yīng)答基因）的轉(zhuǎn)錄3E-SCREEN這樣的增殖試驗(yàn)可能是高度敏感的，并且結(jié)果可能具有相關(guān)性，因?yàn)樵撓到y(tǒng)利用表達(dá)可能介導(dǎo)雌激素效能的內(nèi)源共激活因子的人源細(xì)胞。最近有研究報(bào)道，利用該技術(shù)進(jìn)行了玉米赤霉烯酮及其衍生物的雌激素活性研究，測(cè)量暴露于這些霉菌毒素的ER陽(yáng)性人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）的增殖，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在6.25～25.00μM水平暴露后，通過(guò)使用E-Screen生物測(cè)定評(píng)估細(xì)胞增殖，其結(jié)果顯示了玉米赤霉烯酮及其衍生物在MCF-7細(xì)胞中的雌激素活性0。

2.3分子生物學(xué)方法

熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)是以熒光素為底物檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性的一種報(bào)告系統(tǒng)，熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，其間會(huì)發(fā)出生物熒光，然后可以通過(guò)熒光測(cè)定儀測(cè)定熒光素氧化過(guò)程中釋放的生物熒光07-18?？梢?jiàn)，熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)，是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法"8。目前，按照整個(gè)方法技術(shù)體系，構(gòu)建了雌激素受體亞型介導(dǎo)的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)了使用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的人類雌激素受體（hERalpha）和hERbeta介導(dǎo)的報(bào)告基因測(cè)定，結(jié)果hERalpha報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)E2的最低檢測(cè)限為1.9x10-11mol/L，在1.9x10-8mol/L處獲得最高誘導(dǎo)倍數(shù)，是對(duì)照組的30.7倍。

分子生物學(xué)方法快速、靈敏、特異性高，使類雌激素農(nóng)藥體外檢測(cè)試驗(yàn)更易實(shí)現(xiàn)，可操作性強(qiáng)。用其他激素類受體（如雄激素受體、孕激素受體）替代該體系中的雌激素受體，就可以構(gòu)建檢測(cè)環(huán)境雄激素和環(huán)境孕激素的試驗(yàn)體系。因此，該方法的推廣性好。

3今后研究方向

農(nóng)藥殘留弓發(fā)的問(wèn)題涉及醫(yī)療、飲食建筑、造船、水產(chǎn)養(yǎng)殖等各行各業(yè)021，目前，對(duì)雌激素作用機(jī)制尚不清楚，對(duì)環(huán)境污染物雌激素生物活性的研究還處于探索性研究階段，僅可以根據(jù)有限的試驗(yàn)數(shù)據(jù)推測(cè)哪些環(huán)境污染物可能具有雌激素活性，尚無(wú)足夠的在人體中負(fù)面效應(yīng)的證據(jù)。因此，類雌激素農(nóng)藥作用機(jī)制的深人研究對(duì)了解和確定一種環(huán)境污染物的雌激素性質(zhì)十分必要。另一個(gè)研究方向即研究更多的化學(xué)品和其他壓力因素及其潛在累積影響。多年來(lái)，毒理學(xué)家傾向于避免研究累積效應(yīng)，因?yàn)樗徽J(rèn)為是一個(gè)棘手的問(wèn)題。對(duì)于激素活性劑來(lái)說(shuō)尤其如此，因?yàn)橛写罅康呐潴w和多種來(lái)源，其中不僅包括人造化學(xué)物質(zhì)，還包括植物中的化合物、內(nèi)源性激素，甚至非化學(xué)應(yīng)激物。最后，這方面的未來(lái)研究需要不斷拓展，這意味著關(guān)于內(nèi)分泌系統(tǒng)特定組分的信息（例如特定的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)）需要在全身生理學(xué)的背景下進(jìn)行解釋2。

隨著分子生物學(xué)試驗(yàn)方法的滲透、人類基因組計(jì)劃中人類基因圖譜的繪制完善，生物芯片中毒理芯片的研究很快將成為毒理學(xué)研究的前沿2-24，建立科學(xué)準(zhǔn)確的環(huán)境污染物雌激素活性篩選方法、充分利用人類基因組計(jì)劃研究結(jié)果進(jìn)行毒理芯片的研究是最理想的切人點(diǎn)。

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