高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)魚肉中5 種頭孢類藥物

摘 要：建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)魚肉中5 種頭孢類抗生素（頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢匹林、頭孢喹肟和頭孢唑啉）殘留的檢測(cè)方法。魚肉基質(zhì)經(jīng)乙腈提取，Prime HLB（6 mL，200 mg）固相萃取小柱凈化。采用AB-4500 Qtrap液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，Accucore C18 RP-MS色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），以乙腈和體積分?jǐn)?shù)0.1%的乙酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速0.4 mL/min，柱溫30 ℃。采用電噴霧離子源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：5 種頭孢類藥物在0～75 μg/kg范圍內(nèi)線性良好，且在8 min內(nèi)完全分離；5 種頭孢類藥物的檢出限均為0.5 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg；在10、25、40 μg/kg加標(biāo)水平下，5 種頭孢類藥物的批內(nèi)平均加標(biāo)回收率為81.0%～111.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.41%～10.50%，批間平均加標(biāo)回收率為84.7%～106.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.88%～8.71%。

關(guān)鍵詞：魚肉；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；頭孢類藥物

Abstract： A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS） method was developed for the determination of five cephalosporins in fish （cephalexin， cefalonium， cephapirin， cefquinome and cefazolin）. Samples were extracted with acetonitrile and then the extract was cleaned up with a Prime HLB solid-phase extraction （SPE） cartridge prior to being analyzed using an AB-4500 Qtrap LC-MS/MS system. The chromatographic separation was performed on an Accucore C18 RP-MS column （2.1 mm × 100 mm， 2.7 μm） by gradient elution using a mobile phase made up of acetonitrile and 0.1% acetic acid in water at a 0.4 mL/min flow rate. The column temperature was set at 30 ℃. The analytes were detected using multiple-reaction monitoring （MRM） in the positive electrospray ionization mode and quantified by the external standard method. Complete separation was achieved within 8 min. The calibration curves for all five analytes were linear over the concentration range from 0 to 75 μg/kg. The limit of detection for all analytes was 0.5 μg/kg， and the limit of quantification was 2.0 μg/kg. At spiked levels of 10， 25 and 40 μg/kg， the intra-assay recoveries of all five cephalosporins were 81.0%–111.0% with relative standard deviation （RSD） of 0.41%–10.50%， and the inter-assay recoveries were 84.7%–106.0% with RSD of 0.88%–8.71%.

Keywords： fish； high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； cephalosporins

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802005

中圖分類號(hào)：O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2018）02-0028-05

引文格式：

貝亦江， 王揚(yáng)， 朱凝瑜， 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)魚肉中5 種頭孢類藥物[J]. 肉類研究， 2018， 32（2）： 28-32. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802005. http：//www.rlyj.pub

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頭孢類藥物是以天然頭孢菌素C作為原料，經(jīng)半合成得到的一類β-內(nèi)酰胺類抗生素[1]，對(duì)細(xì)菌表現(xiàn)出廣譜抗菌活性[2]，被廣泛應(yīng)用于臨床和畜牧漁業(yè)[3]。隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化程度的提高，養(yǎng)殖用藥增加，往往導(dǎo)致抗生素的濫用[3]。頭孢類藥物可以引起多種酶、血膽紅素含量的升高，引發(fā)造血系統(tǒng)功能障礙[4-6]。

歐盟、美國(guó)和日本等國(guó)家及地區(qū)對(duì)乳類、肉類及動(dòng)物內(nèi)臟中頭孢類抗生素的殘留量均有嚴(yán)格規(guī)定[7-8]。我國(guó)目前只明確規(guī)定了3 種頭孢類藥物的最高殘留限量[9]，分別為頭孢氨芐0.2 mg/kg、頭孢喹諾0.05 mg/kg、頭孢噻呋1.0 mg/kg。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于頭孢類抗生素的檢測(cè)技術(shù)研究以畜禽肌肉、乳、血漿等樣品居多[10-20]，魚肉中的頭孢類藥物檢測(cè)往往不作為重點(diǎn)，且鮮有報(bào)道。國(guó)內(nèi)外報(bào)道中頭孢類藥物的主要檢測(cè)技術(shù)有微生物法、酶聯(lián)免疫法、毛細(xì)管電泳法和色譜法[21-22]，一般以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spetrometry，LC-MS/MS）法為仲裁方法。目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)分析方法中提供了河豚魚和鰻魚中5 種頭孢類物質(zhì)殘留量的檢測(cè)方法[23]，但該方法缺少對(duì)其他魚類的適用性，且預(yù)處理過程試劑用量較大，對(duì)樣品的凈化程度不夠，基質(zhì)效應(yīng)較大，也容易造成環(huán)境污染。本研究以浙江省主要養(yǎng)殖和捕撈區(qū)域的烏鱧、草魚、鰻魚3 種代表性淡水海魚為研究對(duì)象，建立廣泛適用于魚肉基質(zhì)中頭孢類藥物殘留檢測(cè)的LC-MS/MS方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

池塘養(yǎng)殖烏鱧，2017年5月取自德清縣禹越鎮(zhèn)百畝漾生態(tài)休閑農(nóng)莊，體長(zhǎng)22.5～32.5 cm，體質(zhì)量1.25～2.36 kg；池塘養(yǎng)殖草魚，2017年5月取自浙江恒澤生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，體長(zhǎng)27.5～29.4 cm，體質(zhì)量0.98～1.16 kg；海洋捕撈鰻魚，2017年4月取自溫州南麂島海域，體長(zhǎng)43.3～46.1 cm，體質(zhì)量2.58～3.34 kg。每種魚類樣品各6 批次，每批次6 尾，去皮、去骨后切成0.5 cm見方的肉塊，置于攪拌勻漿機(jī)中攪成糜狀，備用。

頭孢氨芐（純度99.0%）、頭孢喹肟（純度80.1%）、頭孢洛寧（純度95.0%）、頭孢匹林（純度100.0%）、頭孢唑啉（純度96.6%）標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、甲酸和正己烷（均為色譜純） 美國(guó)Tedia公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

AB-4500 Qtrap液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)AB Sciex公司；Accucore C18 RP-MS色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm） 美國(guó)Thermo Fisher公司；Oasis Prime HLB柱（6 mL，200 mg） 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取2.5 g肉糜樣品，加入提取溶劑，渦旋振蕩/超聲15 min，8 000 r/min條件下離心5 min，取上清液。其中，分別選擇乙腈、乙腈水溶液（80∶20，V/V）、甲醇和甲醇水溶液（80∶20，V/V）作為提取溶劑，根據(jù)提取效果選擇合適的提取溶劑。

將Prime HLB小柱（6 mL，200 mg）用3 mL乙腈潤(rùn)濕后上樣，樣品提取液收集至離心管；氮吹至干，加入2 mL水復(fù)溶后振蕩1 min，可根據(jù)樣品性狀有選擇地加入正己烷除脂；將2 mL復(fù)溶后的溶液轉(zhuǎn)移至高速冷凍離心機(jī)，12 000 r/min條件下離心10 min，過0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Accucore C18 RP-MS（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫程序如表1所示；流速0.4 mL/min，進(jìn)樣體積5 μL，色譜柱溫度30 ℃。

其中，分別選擇體積分?jǐn)?shù)0.1%的乙酸水溶液、純水及體積分?jǐn)?shù)0.1%的乙酸水溶液中加入5 mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相A，根據(jù)目標(biāo)化合物的分離效果選擇合適的流動(dòng)相。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）正離子模式（ESI+）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multi reaction monitor，MRM）；電噴霧電壓5 500 V，聚焦電壓300 V，去簇電壓55 V，碰撞室出口電壓20 V；氣化溫度525 ℃。MRM參數(shù)如表2所示。

1.3.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用水配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃貯存，根據(jù)需要稀釋為適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

采用外標(biāo)法定量，因此需繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。將陰性魚糜樣品基質(zhì)按照1.3.1節(jié)中的方法處理，待氮吹至提取液體積為5 mL左右時(shí)加入5 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使其質(zhì)量濃度均分別為0、10、25、50、75 μg/L，繼續(xù)氮吹至干后，復(fù)溶、冷凍、離心、過濾。以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中5 種頭孢類藥物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)定量離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 目標(biāo)化合物的定性和定量

使用Sciex-Analyst軟件，根據(jù)MRM參數(shù)掃描對(duì)5 種頭孢類藥物進(jìn)行定性，試樣中被測(cè)組分的含量按照下式計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

由圖1可知：乙腈水溶液對(duì)各組分的提取率均較高，但提取液中的水分去除較為繁瑣且費(fèi)時(shí)，影響檢測(cè)結(jié)果的精密度和檢測(cè)效率；甲醇和甲醇水溶液對(duì)頭孢喹肟和頭孢氨芐的提取率不高；純乙腈對(duì)各組分的提取率均相對(duì)較高，而且凈化后濃縮方便快捷，目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中動(dòng)物肌肉組織中頭孢類藥物的提取溶劑也以乙腈或乙腈水溶液為主[24-30]，因此本研究選擇純乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 固相萃取柱的選擇

相較于GB/T 22960—2008《河豚魚和鰻魚中頭孢唑林、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[23]中采用的大體積提取液加旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的凈化方式，本研究采用小體積提取液加Prime HLB固相萃取的方式進(jìn)行樣品凈化。Prime HLB柱對(duì)于基質(zhì)中的蛋白質(zhì)、脂類等雜質(zhì)具有明顯的凈化作用[24]，且相較于傳統(tǒng)的固相萃取柱，Prime HLB柱不需要經(jīng)過“活化-上樣-淋洗-洗脫”這一過程，可以直接將提取液過柱后收集待用，大大縮短了過柱時(shí)間，提高了檢測(cè)效率，與其他文獻(xiàn)報(bào)道中的結(jié)論相符[26]。

對(duì)于脂類含量較高的基質(zhì)，經(jīng)Prime HLB柱凈化的樣品可以進(jìn)一步加入正己烷除脂，充分振蕩、離心后，棄去正己烷層，并將提取液冷凍（4 ℃）離心。實(shí)驗(yàn)表明，在12 000 r/min條件下，至少需要離心10 min，使得蛋白質(zhì)在低溫條件下迅速絮集、下沉，進(jìn)一步提高樣品提取液的純度，減少基質(zhì)效應(yīng)。

2.1.3 流動(dòng)相A的選擇

由圖2～4可知：體積分?jǐn)?shù)0.1%的乙酸水溶液作為流動(dòng)相A時(shí)，分離得到的色譜峰峰型良好，信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)均衡，不會(huì)出現(xiàn)不同物質(zhì)間信號(hào)強(qiáng)度差異太大的情況，適合5 種頭孢類藥物的分離；體積分?jǐn)?shù)0.1%的乙酸水溶液中加入5 mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相A時(shí)，對(duì)藥物信號(hào)強(qiáng)度的抑制較強(qiáng)；純水作為流動(dòng)相A時(shí)，不同藥物間的信號(hào)強(qiáng)度差異較大，容易造成定量不準(zhǔn)確。因此選擇體積分?jǐn)?shù)0.1%的乙酸水溶液作為流動(dòng)相A。

2.2 5 種頭孢類藥物的MRM總離子流色譜圖

5 種頭孢類藥物的MRM總離子流色譜圖如圖5所示。

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

由表3可知，5 種頭孢類藥物在0～75 μg/kg范圍內(nèi)線性良好。

在本研究的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)添加較低量的5 種頭孢類藥物的空白魚肉樣品進(jìn)行測(cè)定，以3 倍信噪比

（RS/N=3）和10 倍信噪比（RS/N=10）確定出5 種頭孢類藥物的檢出限和定量限分別為0.5 μg/kg和2.0 μg/kg。

2.4 準(zhǔn)確度、精密度及重復(fù)性

以10、25、40 μg/kg 3 個(gè)水平向樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，樣品共6 批次，每個(gè)批次設(shè)6 個(gè)平行樣。由表4可知：批內(nèi)平均加標(biāo)回收率為81.0%～111.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.41%～10.50%；批間平均加標(biāo)回收率為84.7%～106.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.88%～8.71%。經(jīng)差異顯著性分析，3 種魚肉基質(zhì)中3 個(gè)加標(biāo)水平的5 種頭孢類藥物的批內(nèi)和批間回收率均無(wú)顯著性差異。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

從本中心實(shí)驗(yàn)室各類樣品中抽取50 批次來(lái)自全省各地周邊海域及養(yǎng)殖場(chǎng)的海魚和淡水魚作為實(shí)際樣品，其中草魚11 批次、黃顙魚10 批次、鱖魚5 批次、鯽魚10 批次、大黃魚5 批次、烏鱧4 批次、鰻魚5 批次，采用本研究確定的方法進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行質(zhì)量控制加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，50 批次樣品均未檢出上述5 種頭孢類藥物殘留。

2.6 與國(guó)標(biāo)方法的比較

與國(guó)標(biāo)方法對(duì)比，本研究所確定方法的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在以下幾方面：1）提取溶劑體積由35 mL減少至8 mL，節(jié)約了有機(jī)試劑用量，減少了對(duì)環(huán)境的污染；2）樣品凈化方式由液-液萃取改為固相萃取，能更有效地去除雜質(zhì)，減少基質(zhì)效應(yīng)；3）基質(zhì)種類由河豚魚、鰻魚增加至養(yǎng)殖量更大、養(yǎng)殖范圍更廣的烏鱧、草魚和鰻魚，拓展了方法的應(yīng)用范圍；4）質(zhì)譜進(jìn)樣時(shí)間由15 min減少至8 min，提高了檢測(cè)效率。

3 結(jié) 論

本研究采用LC-MS/MS技術(shù)建立魚肉基質(zhì)中頭孢氨芐、頭孢喹肟、頭孢洛寧、頭孢唑啉和頭孢匹林5 種頭孢類藥物殘留量的檢測(cè)方法，通過繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)方法準(zhǔn)確度和精密度在頭孢類藥物痕量時(shí)仍然符合實(shí)驗(yàn)要求。與現(xiàn)有國(guó)標(biāo)方法相比，本研究確定的方法彌補(bǔ)了樣品基質(zhì)、方法普及度方面的不足，降低了檢出限和定量限，節(jié)約了試劑用量和預(yù)處理時(shí)間，滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)于頭孢類藥物殘留的檢測(cè)要求。

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