基于SELDI—TOF—MS的冷卻灘羊肉微生物差異蛋白分析

摘 要：以托盤密封包裝的冷鮮灘羊肉為研究對象，基于組合蛋白芯片與表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）平臺對灘羊肉表面微生物蛋白進行分析，區(qū)分不同貯藏時間生物樣本之間的差異。通過正交矯正偏最小二乘法判別分析判斷模型第一主成分的得分值（VIP閾值>1），并結(jié)合學(xué)生氏t檢驗的P值（閾值<0.05）尋找差異性表達蛋白。結(jié)果表明：應(yīng)用Biomarker Wizard軟件分析找出差異蛋白峰132 個，其中75 個差異蛋白峰可根據(jù)質(zhì)荷比經(jīng)Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫檢索出對應(yīng)的蛋白質(zhì)，其余57 個差異蛋白峰對應(yīng)的為未知蛋白；從上述差異蛋白中未找到酶類的差異蛋白，但是找到了可能和灘羊肉菌體有關(guān)聯(lián)的19 個菌體蛋白。SELDI-TOF-MS技術(shù)能夠用于檢測冷鮮灘羊肉不同貯藏階段基因表達的各種蛋白質(zhì)，從而發(fā)現(xiàn)大量具有價值的蛋白質(zhì)標(biāo)志分子。

關(guān)鍵詞：灘羊肉；微生物；表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜；差異蛋白

Abstract： Microbial proteins on the surface of tray-packaged chilled Tan sheep meat were analyzed by surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry （SELDI-TOF-MS） and biological samples collected at different times during chilled storage were differentiated. The variable importance in the projection （VIP） value （threshold > 1） of the first principal component of the orthogonal partial least squares-discriminant analysis （OPLS-DA） model was determined and combined with the P value （threshold < 0.05） of students t test to find out the differentially expressed proteins. The results showed that 132 differential protein peaks were obtained by Biomarker Wizard software， 75 of which were identified by searching in the Swiss-Prot database based on their mass-to-charge ratio， and the remaining 57 were unknown proteins. These differential proteins did not include enzymes but included 19 proteins that might associated with bacteria on mutton meat. In summary， SELDI-TOF-MS allows the detection of various differentially expressed microbial proteins at different storage times of chilled Tan sheep meat and consequently the identification of a large number of valuable protein markers.

Keywords： chilled Tan sheep meat； microorganism； surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry （SELDI-TOF-MS）； differential protein

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802006

中圖分類號：TS251.1 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2018）02-0033-07

引文格式：

胡倩倩， 楊波， 羅瑞明， 等. 基于SELDI-TOF-MS的冷卻灘羊肉微生物差異蛋白分析[J]. 肉類研究， 2018， 32（2）： 33-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802006. http：//www.rlyj.pub

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寧夏鹽池灘羊是經(jīng)長期自然選擇和人工選育而成的裘肉兼用型品種，被農(nóng)業(yè)部列為國家二級保護品種。灘羊肉脂肪分布均勻、膻味較輕、肉質(zhì)細嫩鮮美、營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特，深受廣大消費者的喜愛[1-3]。冷鮮灘羊肉是指對嚴(yán)格按照檢疫制度屠宰后的胴體迅速進行冷卻處理，使胴體溫度（以后腿為測量點）在24 h內(nèi)降為0～4 ℃，并在后續(xù)的流通過程中始終保持在0～4 ℃范圍內(nèi)的鮮羊肉[4-8]。

隨著我國人民生活水平的提高，冷鮮肉正逐漸成為我國肉類消費的主流，在冷鮮肉的推廣過程中，微生物對于貨架期的影響是最大問題之一，只有保證食品的質(zhì)量安全，冷鮮肉才能快速、穩(wěn)定地進一步發(fā)展[9-10]。作為生物信息表達的終端層次，蛋白質(zhì)在基因功能詮釋和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)分析等方面顯現(xiàn)出很大的潛力。而蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種系統(tǒng)生物學(xué)研究中十分有力的分析技術(shù)，能從整體角度出發(fā)，對生物體的研究更加多項化。蛋白質(zhì)組由基因組表達，受到環(huán)境條件和處理條件的影響，可以看作是基因組和肉的功能品質(zhì)之間的分子連接[11-14]。蛋白質(zhì)組學(xué)可以解釋不同遺傳背景或不同肉處理方法影響肉質(zhì)的分子機制[15-16]。蛋白質(zhì)組學(xué)的高度發(fā)展已經(jīng)使其在生命科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，也是解決食品安全相關(guān)品質(zhì)以及食品科學(xué)問題的有效性工作，給食品科學(xué)領(lǐng)域提供了更為廣泛的思路和技術(shù)，這些技術(shù)在食品安全領(lǐng)域也被更加廣泛地應(yīng)用[17-20]。近幾年興起的表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）[21-22]技術(shù)為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了一個理想平臺，是一項極有應(yīng)用前景的技術(shù)，將會大大改變目前一些疾病診斷落后的狀況[23-24]。質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的核心，它是一種超微、高通量、全自動篩選蛋白技術(shù)，可以檢測各種樣品，包括血清、尿液和細胞等[25-27]。SELDI-TOF-MS技術(shù)尚未應(yīng)用于肉類，參數(shù)有待進一步完善，以便使其繼續(xù)在肉品等食品中的應(yīng)用得到推廣。

本研究以密封托盤包裝冷鮮灘羊肉為研究對象，采用SELDI-TOF-MS技術(shù)區(qū)分不同貯藏時間冷鮮灘羊肉生物樣本之間的差異，進而尋找造成異同的變量或分子，即差異蛋白。張赫宇等[28]采用宏基因組分析了寧夏冷卻灘羊肉的初始菌相，指出該地區(qū)冷卻灘羊肉中的主要腐敗菌為假單胞菌、乳酸菌、腸桿菌科及葡糖球菌。差異蛋白的尋找能夠為揭示冷鮮肉微生物差異蛋白與樣本的關(guān)聯(lián)性及冷鮮灘羊肉微生物的代謝驅(qū)動研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灘羊后腿肉購自寧夏大夏牧場清真食品有限公司，灘羊飼養(yǎng)期間不做任何生物性防疫，且定期進行清糞、消毒處理。

乙腈（色譜純）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA，色譜純）、無水醋酸鈉（NaAc，分析純）、3-[3-（膽酰氨丙基）二甲銨基]丙磺酸內(nèi)鹽（3-[（3-cholamidopropyl）dimethylammonio]-1-propanesulfonate，CHAPS，色譜純）、三羥甲基氨基甲烷（Tris堿，色譜純）、鹽酸（HCl，分析純）、尿素（Urea，色譜純）、雙[3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基]胺（bis[3-（triethoxysilyl）propyl]amine，SPA，色譜純）、氯化鈉（NaCl，分析純）、氫氧化鈉（NaOH，分析純）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES，色譜純）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT，色譜純）、U9裂解液（5 mL 9 mol/L Urea、2% CHAPS、50 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0）、WCX-2緩沖液（50 mmol/L NaAc，pH 4.0） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PBSIIC型蛋白質(zhì)芯片飛行時間質(zhì)譜儀 美國賽弗吉公司；LDZ5-2型低速自動平衡離心機 北京醫(yī)用離心

機廠；MDF-382型冰箱（-80 ℃） 日本三洋公司；MS1 Minishaker型振蕩器 廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；

PB20型pH測量儀 德國賽多利斯公司；ER-182A型電子天平 日本愛安德公司；微量加樣槍（2、10、20、100、200、1 000 μL） 吉而遜實驗儀器（上海）有限公司；Tips P20、P200、P1000離心管（50 mL）、微形離心管（0.5 mL、1.5 mL） 美國康寧公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

當(dāng)天屠宰的灘羊后腿肉立刻放入干冰中貯存，返回實驗室后迅速放入-20 ℃冰箱放置1 h，使肉的中心溫度降為0 ℃。在無菌條件下，采集0 ℃條件下貯藏的灘羊肉表面刮擦物100 mg（含微生物、血液、肉汁液等），封裝于滅菌冷凍管中待用。采樣時間點分別為0、4、8、12 d，每組樣本做5 個平行[29]。

1.3.2 樣品預(yù)處理

1.3.2.1 細胞淬滅

采用低溫凍結(jié)細胞內(nèi)酶活力的液氮淬滅法對采集的樣本進行淬滅，冰上解凍后收集菌體。冷凍時間為分別靜置1、2、3、4、5 min[30]。

1.3.2.2 菌體分離

將細胞淬滅物在-9 ℃、12 000 r/min條件下冷凍離心3 min，棄上清并用0 ℃的預(yù)冷去離子水洗滌菌體，重復(fù)3 次，得到的菌體凍存于-80 ℃冰箱。

1.3.3 上機檢測

從-80 ℃冰箱中取出菌液，置于冰盒上融解。準(zhǔn)備2 組EP管，取配制好的U9裂解液20 μL加入到500 μL的EP管內(nèi)；再取菌液10 μL加入EP管中，充分混勻；室溫下靜置30 min；向變性后的菌液標(biāo)本中加入370 μL WCX-2緩沖液，盡快混勻；吹打血清樣品（避免產(chǎn)生氣泡）。樣品處理完畢后靜置備用，待上機檢測。

1.3.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理

用Ciphergen Protein Chip 3.2.1軟件（美國Ciphergen公司）收集數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)處理方法參照周繼紅[31]的方法，并略作改動。原始數(shù)據(jù)經(jīng)Ciphergen Protein Chip 3.2.1軟件進行校正處理，得到峰值數(shù)據(jù)，質(zhì)荷比小于1 000的峰值多為基質(zhì)峰，信噪比寬松到3，過濾后在此基礎(chǔ)上進行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

使用Ciphergen Protein Chip 3.2.1軟件自帶的Biomarker Wizard 5.0軟件篩選差異峰，比較不同組樣品間的差異。將2 組樣品的峰值做Wilcoxon秩和檢驗，用計算出的P值判斷峰值是否有顯著差異（P=0.05）。采用t檢驗統(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進行分析，進一步采用SPSS 12.0軟件中的ROC（receiver operating characteristic）曲線分析差異蛋白，α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 灘羊肉微生物差異峰篩選

比較各組樣品的差異峰篩選結(jié)果，以0.05作為P值的閾值，篩選差異峰。由表1～3可知，所篩選的差異峰結(jié)果有益于接下來差異蛋白的建模。

2.2 灘羊肉微生物層次聚類分析

2.3 灘羊肉微生物的多元變量分析

應(yīng)用主成分分析（principal component analysis，PCA）對貯藏0～4、4～8、8～12 d的冷鮮灘羊后腿肉表面刮擦物的SELDI-TOF-MS結(jié)果進行分析。使用SIMCA軟件（V14，Umetrics AB，Umea，Sweden）對模型進行正交矯正偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），最大化地凸顯模型內(nèi)部與預(yù)測主成分相關(guān)的差異。OPLS-DA首先進行UV格式化處理的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算，接著對第一、第二主成分進行建模分析。模型的質(zhì)量用7 折交叉驗證進行檢驗，并用交叉驗證后得到Y(jié)變量的可解釋性和模型的可預(yù)測性對模型的有效性進行評判。然后，通過排列實驗隨機多次（n=200）改變分類變量Y的排列順序，得到相應(yīng)不同的隨機預(yù)測值，對模型有效性進行進一步檢驗。

模型的可預(yù)測性越接近1，說明OPLS-DA模型越能很好地解釋2 組樣本之間的差異。由表4可知，3 組灘羊肉微生物間的差異很明顯。

由圖4～6可知，OPLS-DA得分圖表明貯藏0～4、4～8、8～12 d的冷鮮灘羊肉能夠完全區(qū)分，但貯藏0～4 d組和貯藏8～12 d組內(nèi)呈一定的發(fā)散分布，這表明2 組冷鮮灘羊肉的組內(nèi)差異蛋白存在明顯差異。3 組模型的可解釋變量R2X分別為0.705、0.770和0.733；3 組監(jiān)督模型的解釋率R2Y分別為0.977、0.992和0.989；3 組模型的可預(yù)測度Q2分別為0.931、0.959和0.936，這說明該模型有很好的預(yù)測性。3 組樣品的置換檢驗圖截距R2分別為0.409、0.742和0.715；Q2分別為-0.882、-0.617和

-0.645，說明置換檢驗圖可以很好地體現(xiàn)模型的穩(wěn)健性。3 組樣品的載荷圖左右兩端物質(zhì)為潛在差異標(biāo)志物，圖中三角代表2 組虛擬的Y值，距離三角越近的X變量對應(yīng)的蛋白質(zhì)具有更好地區(qū)分2 組樣品的能力。因此，構(gòu)建的OPLS-DA模型能夠很好地區(qū)分3 組樣品的差異蛋白質(zhì)。

2.4 灘羊肉微生物差異蛋白的預(yù)測

以Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)，利用自有代碼編寫的軟件將SELDI數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)的氨基酸分子質(zhì)量進行比較，找到最為相似的蛋白質(zhì)作為預(yù)測結(jié)果。不同貯藏時間灘羊肉微生物差異蛋白的詳細預(yù)測信息如表5～7所示。未檢索出的其他蛋白質(zhì)可能為未知蛋白質(zhì)。

從上述差異蛋白中找到了可能和灘羊肉菌體有關(guān)聯(lián)的19 個菌體蛋白，分別為ATP合成蛋白、生長調(diào)節(jié)α蛋白、壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白、還原型輔酶Ⅰ-泛醌氧化還原酶鏈4L、生長抑制素-28、生長激素釋放素、60S核糖體蛋白L40、角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白8-1、抗菌肽、ATP合酶F（0）復(fù)合體亞基C1、編碼載脂蛋白、朊蛋白類、角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白3-1、硫氧還蛋白、β2-微球蛋白、巨噬細胞移動抑制因子、40S核糖體蛋白S26、載脂蛋白E、磷脂結(jié)合蛋白。

3 結(jié) 論

以灘羊肉表面刮擦物為研究對象，應(yīng)用組合蛋白芯片與SELDI-TOF-MS技術(shù)對不同貯藏時間灘羊肉表面的刮擦物微生物進行分析。在整個數(shù)據(jù)預(yù)處理過程中分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析包括差異峰篩選、層次聚類分析、PCA、OPLS-DA模型構(gòu)建、差異峰對應(yīng)蛋白預(yù)測。共預(yù)測差異蛋白峰132 個，其中75 個可根據(jù)質(zhì)荷比經(jīng)Swiss-Prot

數(shù)據(jù)庫檢索出對應(yīng)的蛋白質(zhì)；從上述差異蛋白中找到了可能和灘羊肉菌體有關(guān)聯(lián)的19 個菌體蛋白，分別為ATP合成蛋白、生長調(diào)節(jié)α蛋白、壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白、還原型輔酶Ⅰ-泛醌氧化還原酶鏈4L、生長抑制素-28、生長激素釋放素、60S核糖體蛋白L40、角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白8-1、抗菌肽、ATP合酶F（0）復(fù)合體亞基C1、編碼載脂蛋白、朊蛋白類、角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白3-1、硫氧還蛋白、β2-微球蛋白、巨噬細胞移動抑制因子、40S核糖體蛋白S26、載脂蛋白E、磷脂結(jié)合蛋白。

差異蛋白的尋找有助于深入探究灘羊肉微生物的代謝過程，因此能夠為揭示冷鮮肉微生物差異蛋白與其的關(guān)聯(lián)性提供理論參考，為研究冷鮮灘羊肉微生物的代謝驅(qū)動打下基礎(chǔ)，揭示微生物群落演替的內(nèi)在驅(qū)動機制，為冷鮮灘羊肉加工技術(shù)創(chuàng)新提供參考。

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