體外培養(yǎng)鴿嗉囊組織形態(tài)學(xué)、酶活力及基因表達(dá)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

萬(wàn)雪萍，謝 鵬，卜 柱，湯青萍，鄒曉庭*

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江省飼料與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部（華東）動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江大學(xué)動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310058；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇揚(yáng)州 225125；3.淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江蘇淮安 223001）

嗉囊是鳥(niǎo)類儲(chǔ)存和軟化食物的重要場(chǎng)所，同時(shí)也是抵御病原體入侵的功能性屏障，在鳥(niǎo)類先天免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中扮演重要角色[1]。不同于其他家禽，鴿嗉囊還具有類似于哺乳動(dòng)物乳腺的“泌乳”功能。在育雛期，嗉囊受催乳素作用，上皮細(xì)胞積聚營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并發(fā)生角質(zhì)化，最終脫落形成“鴿乳”[2]。作為理想的實(shí)驗(yàn)靶器官，近十年來(lái)鴿嗉囊已在流行病學(xué)、組織生理學(xué)及禽類營(yíng)養(yǎng)與分子育種等領(lǐng)域得到廣泛研究，然而大多數(shù)研究主要集中于體內(nèi)試驗(yàn)，體外試驗(yàn)鮮有報(bào)道[3-4]。與動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)相比，體外試驗(yàn)具有試驗(yàn)周期短、成本低、環(huán)境因子可控等優(yōu)點(diǎn)[5]，其中，組織培養(yǎng)技術(shù)可以較好地模擬體內(nèi)的環(huán)境狀態(tài)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換情況，有利于從整體水平評(píng)估外界因素對(duì)靶器官的影響[6]。研究人員已成功運(yùn)用組織體外培養(yǎng)技術(shù)完成對(duì)犢牛睪丸、鴿小腸等組織的體外培養(yǎng)，并且通過(guò)檢測(cè)體外培養(yǎng)組織形態(tài)學(xué)和酶活指標(biāo)的變化探索出最佳的體外給藥時(shí)間[7-8]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于鴿嗉囊組織體外培養(yǎng)尚未見(jiàn)報(bào)道，其在離體培養(yǎng)條件下的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律有待于揭示。鑒于此，本研究采集鴿嗉囊組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，檢測(cè)體外培養(yǎng)0～7 d鴿嗉囊組織形態(tài)學(xué)、Caspase-3酶、琥珀酸脫氫酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶和總ATP酶活力及Bcl-2、Bak1和角蛋白19（CK-19）基因表達(dá)的變化，旨在揭示體外培養(yǎng)環(huán)境下鴿嗉囊組織活性變化規(guī)律，并探索其體外培養(yǎng)的適宜時(shí)間，為今后開(kāi)展以鴿嗉囊為載體的營(yíng)養(yǎng)學(xué)、生理學(xué)及病理學(xué)等體外試驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣本來(lái)源 60周齡健康哺育期美國(guó)王鴿，采集嗉囊組織。試驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自江陰市威特凱鴿業(yè)有限公司。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清、DMEM/F-12和青鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，牛胰島素、皮質(zhì)醇和表皮生長(zhǎng)因子均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，PBS緩沖液、4%多聚甲醛、無(wú)水乙醇、95%乙醇、伊紅、蘇木紫、中性樹(shù)脂、二甲苯均購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶科技有限公司，Caspase-3酶、琥珀酸脫氫酶（SDH）及ATP酶（Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶以及總ATP酶）活性測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，瓊脂糖和Trizol裂解液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，ReverTra Ace?反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自中國(guó)大連寶生物工程有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 Galaxy 系列二氧化碳培養(yǎng)箱（英國(guó)RS Biotech 公司），SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），高壓滅菌鍋（ZDX-35BI型，座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器），一次性培養(yǎng)瓶（Costar，美國(guó)），切片機(jī)（Leica，德國(guó)），光學(xué)顯微鏡（尼康，日本），Mx3000P熒光定量PCR儀，分光光度計(jì)（UV-2000，Unico，Instruments，上海，中國(guó)），Champ GelTM 5000 型凝膠成像系統(tǒng)（Vilber，法國(guó)），ND-1000核酸/蛋白濃度測(cè)定儀（Wilmington，美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 嗉囊組織分離培養(yǎng) 取60周齡哺育期美國(guó)王鴿4只，采集嗉囊組織，PBS沖洗，放入組織清洗液（500 mL PBS+5 mL 100 U/mL青鏈霉素）低溫帶入無(wú)菌操作室。在超凈工作臺(tái)中用組織清洗液沖刷嗉囊樣本3遍，隨后放入組織浸泡液（40 mL PBS+2 mL 100 U/mL青鏈霉素）中浸泡20 min，浸泡完畢后，移入組織清洗液中沖洗3遍。剝離脂肪、結(jié)締組織及表皮組織，將剩余組織剪成2～3 mm3大小，均勻接種于培養(yǎng)瓶中，加入5 mL培養(yǎng)液（DMEM/F12+5%胎牛血清+100 U/mL青鏈霉素+0.5 μg/mL皮質(zhì)醇+10 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子+5 μg/mL牛胰島素），于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7 d，間隔24 h更換1次培養(yǎng)液。于培養(yǎng)第0、1、2、3、4、5、6、7天收集組織塊進(jìn)行形態(tài)學(xué)、酶活力及基因表達(dá)檢測(cè)。

1.2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 取嗉囊組織放置4%多聚甲醛中固定24 h后，采用常規(guī)方法脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色、透明、封片、光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像。

1.2.3 組織酶活力測(cè)定 采用酶活測(cè)定試劑盒檢測(cè)組織Caspase-3、琥珀酸脫氫酶（SDH）及ATP酶（Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶以及總ATP酶）活力。試劑配制和試驗(yàn)操作遵照公司說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。本試驗(yàn)通過(guò)計(jì)算試驗(yàn)組OD405nm/陰性對(duì)照組OD405nm來(lái)確定Caspase-3的活化程度。

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)Bcl-2、Bak 1和CK-19基因表達(dá) 用Trizol法抽提各時(shí)間點(diǎn)組織塊總RNA并檢測(cè)其濃度、純度以及完整性。取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄制備cDNA模板，構(gòu)建熒光定量PCR體系（20 μL）。反應(yīng)條件：95℃變性30 s，95℃退火10 s，60℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中鴿基因序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，引物信息見(jiàn)表1。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，并以 2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 本試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0 軟件的One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P＜0.05表示為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 鴿嗉囊組織體外培養(yǎng)0～7 d形態(tài)學(xué)觀察 如圖1所示，體外培養(yǎng)第0～4天，鴿嗉囊組織層次結(jié)構(gòu)清晰，上皮基層和棘層細(xì)胞胞質(zhì)增多，細(xì)胞核染色逐漸變淺，細(xì)胞排列緊密，上皮淺層結(jié)構(gòu)完整（圖1a～e）。體外培養(yǎng)5 d后，嗉囊組織層次結(jié)構(gòu)逐漸模糊，上皮基層和棘層細(xì)胞排列逐漸松散，上皮淺層出現(xiàn)凋落。體外培養(yǎng)7 d，嗉囊上皮基層和棘層細(xì)胞呈零散分布，嗉囊組織正常形態(tài)結(jié)構(gòu)基本消失（圖1f～h）。

表1 熒光定量PCR反應(yīng)引物序列

圖1 鴿嗉囊組織體外培養(yǎng)0～7 d形態(tài)學(xué)觀察（20×，標(biāo)尺為 500 μm）

2.2 鴿嗉囊組織體外培養(yǎng)0～7 d酶活力檢測(cè) 如表2所示，鴿嗉囊組織Caspase-3酶活性于培養(yǎng)第1天顯著升高至峰值（P＜0.05），隨后于培養(yǎng)第2～4天維持穩(wěn)定水平，體外培養(yǎng)5 d后其活性顯著升高（P＜0.05）。SDH酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及總ATP酶活性均于體外培養(yǎng)第1天顯著降低隨后顯著提高（P＜0.05）。SDH酶活力于培養(yǎng)第2～4天顯著高于培養(yǎng)第5～7天（P＜0.05）。Na+-K+-ATP 酶以及 Ca2+-Mg2+-ATP酶均于體外培養(yǎng)第2～4天維持較高活性，隨后于體外培養(yǎng)第7天降至最低水平（P＜0.05）。總ATP酶活性于體外培養(yǎng)第3天顯著升高至峰值，于培養(yǎng)第5～7天活性顯著受抑制（P＜0.05）。

2.3 鴿嗉囊組織體外培養(yǎng)0～7 dBcl-2、Bak1和CK-19基因表達(dá)變化 由表3可知，鴿嗉囊組織Bcl-2和CK-19基因表達(dá)均于體外培養(yǎng)第1 天顯著下調(diào)（P＜0.05）。隨后，Bcl-2基因表達(dá)于體外培養(yǎng)第2～4天顯著升高（P＜0.05），于體外培養(yǎng)5 d后顯著降低（P＜0.05）。CK-19基因表達(dá)于體外培養(yǎng)第4天升高至峰值，隨后于體外培養(yǎng)第6～7天顯著降低（P＜0.05）。鴿嗉囊組織Bak1基因于體外培養(yǎng)第1天表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），隨后穩(wěn)定至體外培養(yǎng)第5天（P＞0.05），并于培養(yǎng)第6～7天其表達(dá)再次顯著上調(diào)（P＜0.05）。

表 3 體外培養(yǎng)0～7 d鴿嗉囊組織基因表達(dá)變化（n=3）

3 討 論

組織體外培養(yǎng)能夠在原生基質(zhì)中維持細(xì)胞的活性，并保留細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，從而為觀察組織在外界刺激下的形態(tài)學(xué)變化、內(nèi)環(huán)境因子調(diào)控過(guò)程等創(chuàng)造了良好的試驗(yàn)技術(shù)手段[9]。本研究以體外培養(yǎng)鴿嗉囊組織為基礎(chǔ)，動(dòng)態(tài)檢測(cè)了離體條件下組織的形態(tài)學(xué)、酶活力及基因表達(dá)變化。與前人報(bào)道的體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果類似[10]，本試驗(yàn)中，體外培養(yǎng)前期（體外培養(yǎng)1～4 d）鴿嗉囊組織上皮層結(jié)構(gòu)完整且細(xì)胞胞質(zhì)逐漸增多，表明鴿嗉囊組織細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下仍維持細(xì)胞增殖的活性，且具有合成胞內(nèi)物質(zhì)的能力。體外培養(yǎng)5 d后鴿嗉囊組織結(jié)構(gòu)迅速崩解，可能是由于部分細(xì)胞死亡導(dǎo)致。

表2 體外培養(yǎng)0～7 d鴿嗉囊組織酶活力變化（n=3） U/mg pro

Caspase-3是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起著樞紐作用。體外培養(yǎng)細(xì)胞促凋亡試驗(yàn)過(guò)程中，Caspase-3酶活力顯著增加[11]。本試驗(yàn)中，Caspase-3酶活力于培養(yǎng)第1天顯著升高至峰值，于體外培養(yǎng)5 d后酶活再次顯著升高，由此推測(cè)鴿嗉囊組織進(jìn)入體外培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)可能經(jīng)歷了一段時(shí)間的適應(yīng)過(guò)程，并且組織于體外培養(yǎng)后期可能處于細(xì)胞凋亡活躍階段。SDH為線粒體電子傳遞系統(tǒng)的一種三羧酸循環(huán)酶，是反映線粒體功能的標(biāo)志酶之一。在動(dòng)物受損組織中，SDH活力顯著受抑制[12]。本研究中，鴿嗉囊組織SDH活力于體外培養(yǎng)第5～7天顯著低于培養(yǎng)第2～4天，推測(cè)體外培養(yǎng)的鴿嗉囊組織代謝活動(dòng)于4 d后顯著受抑制。ATP酶是衡量細(xì)胞生理狀況的重要指標(biāo)，其主要功能是水解ATP、釋放能量、離子運(yùn)輸?shù)取C(jī)體的ATP酶主要分為Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶2種。Na+-K+-ATP酶維持著細(xì)胞膜兩側(cè)的膜電位，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收提供動(dòng)力；Ca2+-Mg2+-ATP酶活性變化影響細(xì)胞的分泌與增殖。鈣離子平衡失調(diào)的體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶均顯著下調(diào)[13]。本試驗(yàn)中，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及總ATP酶活力在體外培養(yǎng)第1天均顯著降低，隨后均于培養(yǎng)2～4 d維持于高酶活水平，并于體外培養(yǎng)5～7 d再次顯著下降，筆者推測(cè)，體外培養(yǎng)鴿嗉囊組織在進(jìn)入體外環(huán)境時(shí)其細(xì)胞膜經(jīng)歷了離子轉(zhuǎn)運(yùn)穩(wěn)態(tài)的失調(diào)，隨后恢復(fù)較好的穩(wěn)態(tài)并維持至培養(yǎng)第4天，培養(yǎng)5 d后內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)再次失衡。本試驗(yàn)中，離體培養(yǎng)鴿嗉囊組織ATP酶活力變化與其形態(tài)學(xué)改變趨勢(shì)相吻合，這可能是由于ATP酶活力的變化影響了細(xì)胞能量代謝及細(xì)胞膜內(nèi)外離子平衡過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能的改變。

Bcl-2家族通過(guò)維持線粒體膜的穩(wěn)定性來(lái)影響細(xì)胞內(nèi)源性凋亡，其家族成員根據(jù)功能一般可分為抗凋亡（如Bcl-2、Bcl-xl）和促凋亡（如 Bax、Bak）2類[14]。本試驗(yàn)中體外培養(yǎng)鴿嗉囊組織Bcl-2基因表達(dá)于培養(yǎng)第1、5、6、7天顯著低于其他時(shí)間，Bak1基因表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間呈上調(diào)趨勢(shì)，結(jié)合形態(tài)學(xué)及Caspase-3酶活變化規(guī)律，研究結(jié)果進(jìn)一步表明體外培養(yǎng)4 d后鴿嗉囊組織細(xì)胞凋亡過(guò)程顯著加快。細(xì)胞角蛋白（CKs）是上皮類細(xì)胞重要的標(biāo)志，角蛋白在鴿嗉囊角質(zhì)化產(chǎn)乳過(guò)程中具有重要作用[15]。本試驗(yàn)中，CK-19基因于體外培養(yǎng)第2～4天顯著上調(diào)，隨后于體外培養(yǎng)6～7 d顯著下調(diào)，這可能與嗉囊上皮細(xì)胞增殖及角質(zhì)化過(guò)程有關(guān)[2]。

4 結(jié) 論

體外培養(yǎng)鴿嗉囊組織的形態(tài)學(xué)、Caspase-3酶、琥珀酸脫氫酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+- ATP酶和總ATP酶活力及Bcl-2、Bak1和CK-19基因表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)規(guī)律性變化。本試驗(yàn)條件下，鴿嗉囊組織體外培養(yǎng)活性的最佳時(shí)間為4 d。

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