馬鈴薯晚疫病菌原生質(zhì)體制備及再生體系的研究

王偉偉 肖燕 張藝夕 劉晶 唐唯 李燦輝

（1. 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500；2. 云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院，昆明 650500）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）屬茄科一年生草本植物，原產(chǎn)地南美洲安第斯山區(qū)，是世界第三大糧食作物［1］。我國是世界上馬鈴薯主要生產(chǎn)國家之一，馬鈴薯也是我國第四大糧食作物。由致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病是一種毀滅性病害，已超過稻瘟病和小麥銹病，被視為國際第一大作物病害［2］。

致病疫霉（Phytophthora infestans）是半活體營養(yǎng)型卵菌，菌絲無色、無隔、多核，生活史包含有性生殖和無性生殖兩個(gè)過程，其無性生殖是田間侵染植物的主要方式。馬鈴薯晚疫病菌為二倍體，基因組大小約240 Mb，其中包含上千個(gè)與致病性相關(guān)的效應(yīng)因子與毒性因子。

為進(jìn)一步明確晚疫病菌的致病機(jī)理，需要建立高效的馬鈴薯晚疫病菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系。早在1991年，Judelson等［3］參考植物葉肉細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體系，首次在致病疫霉中建立了用聚乙二醇/氯化鈣（PEG/CaCl2）介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，目前PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系在其他卵菌中也獲得成功，其中包括大豆疫霉［4］（Phytophthora sojae）、同絲水霉［5］（Saprolegnia monoica）、棕櫚疫霉［6］（Phytophthora palmivora）、煙草疫 霉［7］（Phytophthora nicotianae）、蔥 疫 霉［8］（Phytophthora porri） 以 及 橡 樹 疫 霉［9］（Phytophthora ramorum）等。

影響原生質(zhì)體制備的條件有很多，如酶的種類、酶的濃度、酶解時(shí)間和酶解溫度等。由于不同微生物細(xì)胞壁的組成成分不同，所以不同物種要選擇合適的酶進(jìn)行酶解。Weiland［10］等使用纖維素酶（Cellulase）和葡聚糖酶（Dextranase）對(duì)坪草枯萎病腐霉進(jìn)行酶解；陳孝仁［11］等使用崩潰酶（Driselase）和裂解酶（Lysing enzyme）對(duì)大豆疫霉菌進(jìn)行酶解；付麗［12］等使用裂解酶（Lysing enzyme）和纖維素酶對(duì)辣椒疫霉進(jìn)行裂解；劉士旺［13］等使用溶壁酶（Glucancx）、纖維素酶、破壁酶（Lywallzymc）和蝸牛酶（Snail enzyme）對(duì)綠色木霉進(jìn)行酶解，其中Glucancx的裂解效果要比其他單一酶及其組合酶的效果好，可能是由于P. infestans的細(xì)胞壁含有纖維素和β-1，3-葡聚糖多聚物。本研究選用Driselase和Cellulase R-10兩種酶，分別在不同酶濃度、酶作用時(shí)間及不同菌齡條件下進(jìn)行原生質(zhì)體制備和再生的研究，旨在建立高效的馬鈴薯晚疫病菌原生質(zhì)體制備和再生體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 致病疫霉（Phytophthora infestans）菌株110P于2017年分離自云南省昆明市尋甸縣，由云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 致病疫霉生長培養(yǎng)基［14］：PDA培養(yǎng)基：將土豆去皮并切成小塊，稱200 g，加入500 mL水，煮20 min后過濾，取濾液，在濾液中加入15 g葡萄糖，用蒸餾水定容至1 L，用1%氫氧化鈉或鹽酸將PH調(diào)至6.8-7.2，加入15 g瓊脂粉，攪拌均勻，121℃滅菌20 min。黑麥V8液體培養(yǎng)基：60 g黑麥用蒸餾水浸泡36 h，煮沸1 h，4層紗布過濾后加V8蔬菜汁100 mL，蔗糖20 g，1 g CaCO3，攪拌均勻，用蒸餾水定容至1 L，調(diào)PH至7.0，121℃滅菌20 min。原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基［15］：黑麥V8固體培養(yǎng)基，在1 L黑麥V8液體培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂，91.1 g甘露醇，調(diào)PH至7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3 原生質(zhì)體洗液［16］滲透壓調(diào)節(jié)劑Ⅰ：0.35 mol/L氯化鈣，主要用于原生質(zhì)體的制備。滲透壓穩(wěn)定劑Ⅱ：0.1 mol/L氯化鈣，0.4 mol/L甘露醇，主要被用于沖洗酶液和稀釋原生質(zhì)體。分別將這兩種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)PH至6.2，并于121℃滅菌20 min。

1.1.4 細(xì)胞壁裂解酶 Driselase（Lot.No.1220E021）、Cellulase R-10（Lot.No.926E023）均購于 Solarbio 公司。裂解酶液用滲透壓調(diào)節(jié)劑Ⅰ配制，兩種酶分別配成終濃度為5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL，混勻后1 000 r/min離心2 min取上清，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體的制備 供試菌株置于PDA培養(yǎng)基上，18℃黑暗培養(yǎng)10-18 d，沿菌落邊緣切5 mm×5 mm的菌絲塊，挑10塊置于裝有100 mL的黑麥V8液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于18℃、120 r/min黑暗搖培8 d，400目篩子過濾收集菌絲體，用滅菌的無菌水沖洗3次后用全自動(dòng)樣品快速研磨儀（Fstgrd-24，上海凈信科技）于30 Hz頻率下研磨90 s，再用400目的篩子過濾，收集的菌絲體用滅菌蒸餾水沖洗3次，滲透壓調(diào)節(jié)劑Ⅰ沖洗兩次，用滅菌濾紙吸干，稱重；將菌絲移至50 mL錐形瓶中，加入細(xì)胞壁裂解酶液5-15 mL，于26℃、100 r/min條件下裂解細(xì)胞壁。消化后的細(xì)胞懸浮液經(jīng)400目篩子過濾，同時(shí)用滲透壓穩(wěn)定劑Ⅱ洗滌沉淀3次，最后用滲透壓穩(wěn)定劑Ⅱ重懸沉淀，均勻混合，即可得到原生質(zhì)體。以上步驟均在無菌條件下操作。制備好的原生質(zhì)體在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)［11］。

1.2.2 原生質(zhì)體的再生 在滅菌的超凈工作臺(tái)上，分別取50、100、150 μL原生質(zhì)體懸浮液涂布于再生培養(yǎng)基上，18℃黑暗培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)小菌落，按照下列公式計(jì)算原生質(zhì)體再生率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

再生率=（再生培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)/涂布原生質(zhì)體總數(shù)）×100%。

2 結(jié)果

2.1 原生質(zhì)體的制備

2.1.1 馬鈴薯晚疫病菌無性孢子和原生質(zhì)體的形態(tài) 在普通的光學(xué)顯微鏡下就可以觀察無性孢子（圖1-A）和原生質(zhì)體（圖1-B）的區(qū)別，可以清晰的觀察到檸檬型的無性孢子、部分未被酶解呈絲狀的菌絲體和呈圓形的原生質(zhì)體。在原生質(zhì)體制備的過程中發(fā)現(xiàn)，有些菌絲體已經(jīng)形成斷片，可以看到正在形成原生質(zhì)體的菌絲體末端膨脹變大，釋放出呈圓球狀的原生質(zhì)體；也可以觀察到有一些菌絲體不是從兩端釋放，而是從中間釋放出原生質(zhì)體（圖2）。

2.2 原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化

裂解酶的確定。在酶濃度10 mg/mL、反應(yīng)溫度在26℃條件下，Driselase、Cellulase R-10對(duì)致病疫霉細(xì)胞壁的裂解效果都達(dá)到了較高水平，其中Driselase在60 min時(shí)原生質(zhì)體的產(chǎn)量達(dá)到9.0×104個(gè)/g，Cellulase R-10在45 min時(shí)原生質(zhì)體的產(chǎn)量達(dá)到 8.5×104個(gè) /g。

圖1 致病疫霉無性孢子與原生質(zhì)體的區(qū)別

圖2 致病疫霉原生質(zhì)體的形成方式

2.2.2 裂解酶濃度和反應(yīng)時(shí)間的確定 用Driselase、Cellulase R-10分別裂解致病疫霉菌絲的細(xì)胞壁，制備的原生質(zhì)體的數(shù)量隨著酶液濃度的增加而有明顯變化，10 mg/mL時(shí)產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量最多，15 mg/mL時(shí)產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量反而有所下降。因此進(jìn)行大量原生質(zhì)體制備時(shí)，酶濃度以10 mg/mL最為高效、經(jīng)濟(jì)和適用。

從酶處理15 min開始，隨著處理時(shí)間的延長，原生質(zhì)體產(chǎn)量也逐漸增加，Driselase在60 min時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量最大，達(dá)到9×104個(gè)/g；而Cellulase R-10在45 min時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量最大，達(dá)到8.5×104個(gè)/g；60 min后，隨著酶解時(shí)間的延長，原生質(zhì)體產(chǎn)量呈下降趨勢（圖3、4）。因此，根據(jù)上述結(jié)果，致病疫霉原生質(zhì)體制備最佳條件為Driselase以10 mg/mL的濃度裂解60 min。

圖3 Driselase酶不同濃度和處理時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的影響

圖4 Cellulase R-10酶不同濃度和處理時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的影響

2.2.3 菌齡對(duì)馬鈴薯晚疫病菌原生質(zhì)體制備的影響 在最佳原生質(zhì)體制備條件下，使用10 mg/mL Cellulase R-10和分別生長18 d、14 d、10 d的110P菌絲體進(jìn)行原生質(zhì)體的制備。結(jié)果顯示，3個(gè)菌齡的110P菌絲體中，生長18 d的菌絲體原生質(zhì)體制備總量最高，為7×104個(gè)/g。各菌齡條件下原生質(zhì)體制備量，見表1。

表1 原生質(zhì)體制備量

2.3 原生質(zhì)體的再生

致病疫霉110P用10 mg/mL的Driselase和Cellulase R-10處理60 min后，分別取 50 μL、100 μL、150 μL原生質(zhì)體懸浮液涂布于再生培養(yǎng)基上，菌落在培養(yǎng)4-5 d時(shí)開始大量形成，對(duì)平板菌落計(jì)數(shù)后，原生質(zhì)體再生率最高達(dá)3.1%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。原生質(zhì)體的再生率，見表2。

表2 原生質(zhì)體的再生率

3 討論

探究馬鈴薯晚疫病菌原生質(zhì)體制備和再生的適宜條件，菌齡、脫壁酶的選擇、酶解時(shí)間、酶濃度和滲透壓穩(wěn)定劑等都會(huì)對(duì)原生質(zhì)體的形成率和再生率產(chǎn)生不同影響。本實(shí)驗(yàn)以培養(yǎng)18 d的菌絲體為材料，用10 mg/mL Driselase處理1 g菌絲60 min后，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)8.5×104個(gè)/g；以0.1 mol/L氯化鈣和0.4 mol/L甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑，以黑麥V8固體再生培養(yǎng)基得到的原生質(zhì)體再生率最高達(dá)3.1%。

由于不同種疫霉菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)不同，所以選擇合適的脫壁酶對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量有很大的影響［17］。Weiland 等［10］使用 Cellulase和 Dextranase坪草腐霉進(jìn)行酶解發(fā)現(xiàn)混合酶液的原生質(zhì)體產(chǎn)量較高；陳孝仁等［11］使用Driselase和Lysing enzyme兩種酶對(duì)大豆疫霉菌進(jìn)行酶解發(fā)現(xiàn)，在崩潰酶中加入裂解酶后原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯增多。卵菌的細(xì)胞壁主要有纖維素和β-1，3-葡聚糖多聚物組成，因此本研究參考選用了Driselase和 Cellulase R-10兩種細(xì)胞壁裂解酶。Driselase是一種復(fù)合酶，內(nèi)含昆布多糖酶（Laminarinase）、木聚糖酶（Xylanase）和纖維素酶（Cellulase）［18］，而 Cellulase R-10是一種單一的纖維素酶，一般來說，混合酶液比單一酶液的脫壁效果好，但Driselase是一種復(fù)合酶且含有纖維素酶，本研究用兩種酶分別探索對(duì)P. infestans的裂解效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種酶制備效率差異不顯著（P＞0.05），但Cellulase R-10價(jià)格便宜，在大量制備要求下較為經(jīng)濟(jì)適用。

探索最佳酶解時(shí)間，是獲得最佳原生質(zhì)體制備方法的重要數(shù)據(jù)之一。同時(shí)，還應(yīng)該注意裂解作用的最適溫度，若溫度不當(dāng)，可能會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體被破壞。在原生質(zhì)體的制備過程中，酶濃度宜適中，酶濃度太大易使菌體凝集，不易形成原生質(zhì)體，酶濃度太小使酶解不徹底。酶解時(shí)間也是影響原生質(zhì)體制備的重要因素，如陳孝仁［11］等在制備大豆疫霉原生質(zhì)體時(shí)，酶解時(shí)間在3 h時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量較高；黃玉茜［19］在制備綠色木霉時(shí)，酶解時(shí)間在24 h時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量較好。根據(jù)前人文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體的產(chǎn)量是隨著酶解時(shí)間的增加而增大，當(dāng)達(dá)到最高量時(shí)，隨著酶解時(shí)間進(jìn)一步延長，原生質(zhì)體的產(chǎn)量逐漸降低，整個(gè)過程呈鐘型曲線趨勢，達(dá)到最高點(diǎn)原生質(zhì)體產(chǎn)量下降的主要原因是因?yàn)槊富铍S著作用時(shí)間增加而降低，或原生質(zhì)體數(shù)目不斷增加，在酶解體系中會(huì)變得不穩(wěn)定［20］。本研究所得致病疫霉菌絲酶解作用的最佳時(shí)間為Driselase 1 h，Cellulase R-10僅45 min，比已有文獻(xiàn)報(bào)道時(shí)間的疫霉屬卵菌裂解時(shí)間都短，因此，利用本優(yōu)化條件，在制備原生質(zhì)體的過程中效率更高。

菌齡不同的細(xì)胞，其細(xì)胞壁的薄厚程度以及結(jié)構(gòu)差異較大，是影響原生質(zhì)體制備影響的關(guān)鍵因素之一。菌齡短的菌絲體細(xì)胞壁成分相對(duì)簡單，細(xì)胞壁也相對(duì)薄，容易裂解，但并不是菌齡越短，原生質(zhì)體的生成率越高。菌齡過短會(huì)造成菌絲量不足或影響原生質(zhì)體的再生［21］。不同種類的卵菌酶解時(shí)的最佳菌齡是不一樣的，Yi等［16］的研究報(bào)道辣椒疫霉的菌齡在5 d時(shí)原生質(zhì)體的生成率較高；Judelson等［4］的研究發(fā)現(xiàn)大豆疫霉的菌齡在11 d時(shí)原生質(zhì)體的生成率較高。本研究探索的最佳菌齡為18 d，一個(gè)主要原因就是在最適培養(yǎng)基和最適溫度條件下，致病疫霉110P菌絲生長速率為6.4-7.5 mm/d（本研究測得），大豆疫霉菌絲生長速率為7-9 mm/d［22］，辣椒疫霉為3-4 mm/d［23］，致病疫霉的營養(yǎng)菌絲生長速率較低。

在原生質(zhì)體的再生過程中，滲透壓穩(wěn)定劑是原生質(zhì)體釋放后維持活力的重要因素，對(duì)原生質(zhì)體再生率影響顯著。卵菌的細(xì)胞壁成分是纖維素和葡聚糖，根據(jù)Yi等［16］的研究，用0.1 mol/L氯化鈣和0.4 mol/L甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)，辣椒疫霉的原生質(zhì)體再生率接近6%；董磊［20］用1 mol/L的氯化鎂、0.8 mol/L甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)，致病疫霉的原生質(zhì)體再生率較高，但低于Yi等［16］研究的辣椒疫霉的原生質(zhì)體再生率；本研究選用0.1 mol/L氯化鈣和0.4 mol/L甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑，原生質(zhì)體再生率最高達(dá)3.1%。

研究并建立卵菌高效遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，原生質(zhì)體制備和再生是必不可少的重要方法之一。以原生質(zhì)體為核心的多種操作技術(shù)研究已經(jīng)建立，包括原生質(zhì)體的制備、再生、誘變、融合等方面，在基礎(chǔ)理論研究和實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，這些技術(shù)都發(fā)揮著重要作用［24］。由于不同屬、不同種甚至不同生理小種在制備和再生過程中都存在一定的差異性，因此制備原生質(zhì)體的具體方法和再生條件都有所不同，制備率和再生率波動(dòng)也很大［11］，因此，不同的致病疫霉菌株之間的差異也必然存在，在進(jìn)一步研究中，應(yīng)著重探索不同菌株間原生質(zhì)體制備和再生條件差異、混合裂解酶的制備率，以及滲透壓穩(wěn)定劑的優(yōu)化。

4 結(jié)論

本研究以致病疫霉菌絲為材料，研究了不同菌齡、2種細(xì)胞壁裂解酶、3個(gè)裂解酶濃度、8個(gè)裂解時(shí)間梯度的原生質(zhì)體制備條件和再生效率，建立了原生質(zhì)體最佳制備條件，暨以培養(yǎng)18 d的菌絲體為材料，用10 mg/mL Driselase處理菌絲60 min后，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)9.5×104個(gè)/g；同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，以0.1 mol/L氯化鈣和0.4 mol/L甘露醇作為原生質(zhì)體滲透壓穩(wěn)定劑，以黑麥V8為再生培養(yǎng)基，得到的原生質(zhì)體再生率能達(dá)到3.1%。

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