油茶籽多糖Ⅰ的分離純化、單糖組分及降脂作用

張寬朝， 文 漢， 陶 俊， 王海林

（安徽農業(yè)大學 生命科學學院，安徽 合肥 230036）

油茶（Camellia oleiferaAbel.）是山茶屬植物，常綠灌木或小喬木，起源于中國，分布在廣西、湖南、江西、安徽等中國南方的18個省 （自治區(qū)、直轄市），在東南亞的北部也有少量存在。據(jù)山海經記載，中國利用油茶種子的歷史已超過2 000年[1]。

從油茶籽中提取的油茶油，是一種高品質的食用油，被稱為“東方橄欖油”[2]，與棕櫚油、橄欖油、椰子油并稱世界四大木本油料[3]。油茶油因具有不飽和脂肪酸及多酚含量高等特點，所以是非常健康的[4-5]。油茶油中油酸、亞油酸、不飽和脂肪酸含量均比菜籽油、花生油、大豆油、紅花籽油、豬油含量高[6]。

目前，油茶的種子主要用于制油。最近的研究表明，油茶籽中含有大量生物活性多糖以及蛋白質、脂肪、單寧酸、咖啡因和皂甙等活性成分[7]。因此，應進一步挖掘油茶籽的綜合利用價值。

如今，伴隨肉、脂肪和乳制品消耗的增加，心腦血管疾病正嚴重危害人類健康，而脂質代謝與心腦血管疾病密切相關，脂質代謝紊亂所致的動脈粥樣硬化是引發(fā)心腦血管疾病的重要因素[8]。已知的降脂藥物（他汀類、貝特類、煙酸和膽汁酸螯合劑等）調節(jié)脂質的代謝機理不同，還可能伴有嚴重的不良反應[9]。

研究與開發(fā)天然來源的降脂藥物具有很大的市場需求。多糖是與人類生命功能密切相關的四種基本物質之一。多糖具有多目標、毒性低、臨床應用前景廣等特點。許多研究表明，多糖具有增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、保護消化系統(tǒng)、抗菌、抗病毒、降血糖和脂肪、抗輻射、抗凝血等多種生物學效應。因此，對油茶籽多糖I（CPSⅠ）的分離、純化、單糖成分分析及其對高脂血癥小鼠的降血脂功能進行了研究，為油茶籽的綜合開發(fā)利用提供參考，為進一步研究油茶籽多糖結構與其活性功能的關系提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料 油茶籽：由安徽黃山徽山食用油業(yè)有限公司提供，室溫貯存；四周齡雄性小白鼠（體重20±2 g）：購自安徽中醫(yī)學院動物中心。

1.1.2 試劑 DE-52：Pharmacia公司產品；果糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖及阿拉伯糖：美國sigma-aldrich公司；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒、總膽固醇（T-CHO）試劑盒：長春匯力生物技術有限公司；生理鹽水：安徽豐原藥業(yè)股份有限公司；硫酸軟骨素：蚌埠宏業(yè)生化制藥廠；卵黃乳：上海信然生物科技有限公司；蒽酮、氯化鈉、三氯乙酸、丙酮、濃硫酸、乙酸乙酯、異戊醇、氯仿、甲醇、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等：均為國產分析純。

1.1.3 儀器 高效毛細管電泳儀：美國BECKMAN公司；紫外分光光度計：上海瑞利分析儀器公司；傅立葉變換紅外光譜分析儀：美國熱電公司；MC99-3自動液相色譜分離層析儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；LXJ-IIB大容量低速離心機：上海安亭科學儀器廠；冷凍干燥機：北京德天佑科技發(fā)展有限公司；722S型分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器：昆侖市超聲儀器有限公司；FA1 104分析天平：上海精科天平；旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖含量的測定 蒽酮比色法，以葡萄糖體積為橫坐標，吸光度值為縱坐標，回歸方程為：y=1.581 8x+0.010 4，R2=0.993 4（式中，y 表示 OD620nm，x為葡萄糖體積mL）。

1.2.2 油茶籽多糖的粗提、Sevage法除蛋白質 取冷榨油茶籽餅粉末按1∶3料液比加入蒸餾水，50℃恒溫水浴浸泡120 min，超聲波恒溫水浴浸提30 min，4層紗布過濾，殘渣重復上述操作一次。濾液4 800 r/min離心10 min，取上清液，加入4倍體積95%乙醇，4 800 r/min離心10 min，收集沉淀。Sevage法除蛋白質，得油茶籽多糖粗品。

1.2.3 DEAE-52層析 商品DE-52常規(guī)處理，裝柱，取一定量油茶籽多糖粗品溶液上樣，3 mol/L NaCl溶液和蒸餾水各500 mL梯度洗脫，洗至無糖檢出為止。收集波峰管數(shù)的洗脫液，檢測多糖含量，供Sephadex G-100柱層析使用。

1.2.4 Sephadex G-100柱層析 常規(guī)方法處理Sephadex G-100，裝柱，取一定量DE-52層析純化多糖溶液，上樣。蒸餾水洗脫，控制其流速為1.5 mL/min，收集洗脫液，洗至無糖檢出為止。根據(jù)波峰形成的順序，依次收集得油茶籽粗純化多糖I、油茶籽粗純化多糖Ⅱ、油茶籽粗純化多糖Ⅲ。

1.2.5 紅外光譜分析 以傅立葉變換紅外光譜儀對油茶籽粗純化多糖I進行分析。

1.2.6 親和層析 Sephadex G-100柱層析后油茶籽粗純化多糖I溶液上銅離子-瓊脂糖凝膠親和層析柱，0.2 mol/L、pH 6.0磷酸鹽緩沖液洗脫，得精制油茶籽多糖Ⅰ（CPSI）。

1.2.7 透析、濃縮、冷凍干燥 CPSI經蒸餾水透析，50℃水浴濃縮。冷凍干燥，收集所得即為CPSI精品。

1.2.8 毛細管電泳測定油茶籽多糖Ⅰ的單糖組成

1）電泳條件。 石英毛細管柱（58.5 cm×75 μm，有效長度48.5 cm）；運行緩沖液：100 mmol/L硼砂溶液（pH=10.50）；電壓：15 kV；壓力進樣：0.5 Pa×20 s；柱溫：25℃；檢測波長：245 nm。樣品及緩沖液于4℃儲存，使用前0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2）多糖的水解。精確稱取CPSI 20.0 mg，加入2.0 mL、2 mol/L的H2SO4溶液，于10 mL具塞試管內100℃水解8 h后，得水解樣品溶液。以4 mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0，以水稀釋至5.0 mL，離心，上清液為多糖水解樣品，備用。

3）衍生物的制備

標準單糖混合液的配制：分別精密稱取0.0 018 g甘露糖、0.0 036 g半乳糖、0.0 036 g鼠李糖、0.0 030 g木糖，加水溶解并定容至10 mL。

標準單糖混合液的衍生：精密吸取50 μL單糖混合液，加入 50 μL、0.3 mol/L NaOH 和 50 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液，渦旋混合30 s，具塞試管內70℃水浴反應30 min，冷卻至室溫，加入50 μL、0.3 mol/L HC1中和，以100 μL去離子水稀釋混勻后，加入氯仿1 mL渦漩混勻30 s，靜置5 min，重復萃取上層水相2次，0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣。

多糖水解樣品的衍生：將水解后的CPSI按標準單糖衍生化的方法處理，進樣。

1.2.9 油茶籽多糖Ⅰ降血脂研究

1）試劑的配制。75%蛋黃乳注射液、2 mg/mL硫酸軟骨素注射液、低劑量CPSI注射液 （0.5 mg/mL CPSI注射液）、中劑量CPSI注射液（1 mg/mL CPSI注射液）、高劑量CPSI注射液（2 mg/mL CPSI注射液）。

2）高脂模型的建立。將小鼠分成兩組，其中空白對照組小鼠每天注射0.5 mL的生理鹽水，其它小鼠每天注射0.5 mL的75%蛋黃乳，第三天禁食12 h后剪尾采血測小鼠TC含量，取其中造模成功的小鼠。

3）分組與指標測定。取造模成功的小鼠隨機分組，分別為高劑量組、中劑量組、低劑量組、高脂組、陽性對照組。其中，高劑量組、中劑量組、低劑量組每天注射0.5 mL蛋黃乳和相應濃度的CPSⅠ注射液；陽性對照組每天注射0.5 mL蛋黃乳和0.2 mL硫酸軟骨素；高脂組每天注射0.5 mL蛋黃乳和0.2 mL生理鹽水；空白組每天注射0.7 mL生理鹽水；多糖對照組每天注射0.5 mL生理鹽水和0.2 mL均劑CPSⅠ注射液。

連續(xù)維持7 d，禁食12 h后剪尾采血，測定TCHO，HDL-C，LDL-C 和 HMG-CoA。

注射CPSⅠ后第5天起收集小鼠糞便，70℃烘干至恒質量。以料液比1∶30加入冷丙酮，20℃超聲波提取60 min，離心，上清液即為粗糞固醇。

1.3 數(shù)據(jù)的處理與分析

實驗數(shù)據(jù)用v7.55版DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)統(tǒng)計分析，以EXCEL 2003作圖。

2 結果與討論

2.1 DE-52分離粗多糖

目前在多糖純化中陰離子交換層析法是普遍采用的一種方法。經DE-52柱分離后，自動部分收集器收集各組分，蒽酮比色法測定多糖。DE-52離子交換層析圖譜見圖1。DE-52為中等堿性陰離子交換劑，可用以分離中性多糖與酸性多糖，圖1中出峰較為集中且僅有1個峰，表明冷榨油茶籽餅中主要為帶負電荷的酸性粗多糖，且多糖各組分間等電點差異較小。因此，下一步對DE-52分離后的樣品采用Sephadex G-100進行分離，以便根據(jù)相對分子質量大小差異進一步純化油茶多糖各組分。

圖1 DE-52分離粗多糖Fig.1 Elution of crude polysaccharide by DE-52 column

2.2 Sephadex G-100純化油茶多糖

DE-52分離后的樣品經Sephadex G-100柱分離，自動部分收集器收集各組分，蒽酮比色法測定多糖。Sephadex G-100層析圖譜見圖2。根據(jù)油茶籽粗多糖中各組分相對分子質量的差異，可得3個多糖峰，依次命名為油茶籽粗純化多糖I（CCPS I）、油茶籽粗純化多糖Ⅱ（CCPSⅡ）、油茶籽粗純化多糖Ⅲ（CCPS Ⅲ）。

圖2 Sephadex G-100純化油茶多糖Fig.2 Purification diagram of CPS on Sephadex G-100 column

油茶籽粗多糖三個Sephadex G-100純化組分中，CCPS I含量較多、相對分子質量較大，而且經過預實驗發(fā)現(xiàn)其較CCPSⅡ、CCPSⅢ降血脂效果顯著。因此，后續(xù)重點研究CCPS I。

2.3 油茶籽粗多糖I的紅外光譜分析

從紅外光譜圖3-4可以看出，CCPSⅠ樣品在1 000～1 200cm-1有多糖類吸收峰，在844±8 cm-1有吸收峰，說明CCPSⅠ是α-的端基差向異構體，C-H是平伏的。與磷酸鹽標準圖對比發(fā)現(xiàn)，兩者在940-970 cm-1均存在非常強的PO43+對稱伸縮，且吸收峰峰位對比發(fā)現(xiàn)，除多糖類吸收峰位外，兩者峰位有較高一致性，因此認為，CCPSⅠ與磷酸鹽具有較高的曲線匹配度，而實驗操作中未引入磷酸鹽，同時，CCPSⅠ可以和蒽酮發(fā)生顯色反應，故推測CPSⅠ可能為結合磷酸基團的復合多糖。

圖3 油茶籽粗純化多糖I（CCPS I）的紅外光譜圖Fig.3 CCPS I IR map

圖4 磷酸鹽標準圖Fig.4 Phosphate standard map

因此，根據(jù)磷酸基團能與金屬離子螯合的特點，采用特異性較高的銅離子-瓊脂糖凝膠親和層析進一步純化CCPSⅠ，實驗獲得單一洗脫峰，波峰管溶液可與蒽酮-硫酸發(fā)生特異性顯色反應，進一步驗證CPSⅠ可能為結合磷酸基團的復合多糖。同時，通過親和層析純化，獲得了經精制純化的油茶籽多糖Ⅰ（CPSⅠ）。

2.4 CPSⅠ的單糖組成

在圖5中，a為油茶籽CPSⅠ水解后的毛細管電泳圖譜，b是標準單糖混合液的毛細管電泳圖譜。由圖可知，油茶籽CPSⅠ經酸水解成為兩種單糖，其圖譜中兩個峰分別與混標中的木糖、半乳糖的出峰時間相對應，可以得出油茶籽CPSⅠ由木糖和半乳糖兩種單糖組成。

圖5 4種標準單糖混合液及CPSⅠ水解后的電泳圖譜Fig.5 Electrophoretogram of four standard mixture simple sugars and CPSⅠ

根據(jù)圖5中各單糖的峰面積，計算可知油茶籽CPSⅠ的水解液中半乳糖和木糖的摩爾比為4.6∶5.57。

2.5 CPSⅠ對高血脂小鼠T-CHO、HDL-C、LDLC的影響

總膽固醇（T-CHO）是血液中所有脂蛋白所含膽固醇之總和?？偰懝檀荚龈呤菍е聞用}粥樣硬化的一個非常重要的危險因素。表1數(shù)據(jù)表明，各種濃度多糖降脂程度依次是高劑量、中劑量、低劑量油茶籽多糖，其中中濃度和高濃度比硫酸軟骨素降脂效果好。且多糖對照組較空白組小，更好地說明了CPSⅠ具有較好的降脂效果。

高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），能夠驅動膽固醇逆轉運，通過逆轉運作用把血液和組織中多余的膽固醇攜帶經肝臟分解逆向排除體外。表2數(shù)據(jù)表明，各種濃度CPSⅠ注射液不能提高血液中HDL-C的濃度，不具有生物統(tǒng)計學意義。

表1 CPSⅠ對高血脂小鼠T-CHO、HDL-C、LDL-C的影響（n=6，±s）Table 1 Effect of CPSⅠon serum T-CHO，HDL-C，LDL-C in hyperlipidemia mice（n=6，±s）

表1 CPSⅠ對高血脂小鼠T-CHO、HDL-C、LDL-C的影響（n=6，±s）Table 1 Effect of CPSⅠon serum T-CHO，HDL-C，LDL-C in hyperlipidemia mice（n=6，±s）

注：a 為 p＜0.05，b 為 p＜0.01。

處理T-C H O/(m m o l/L)H D L-C/(m m o l/L)L D L-C/(m m o l/L)高脂組5.6 8±1.0 8 2.2 6±1.3 7 1.0 3±0.6 7 2.3 3±0.7 6 b 高劑量組中劑量組3.3 1±0.2 5 b 1.7 6±0.2 9 b 1.8 2±0.3 4 a 4.0 6±1.8 7 1.1 5±0.3 6低劑量組1.9 4±1.5 3 1.8 1±0.5 6 b多糖對照組0.4 2±0.0 4 a 2.1 6±0.3 1 b 1.3 8±0.3 7 b陽性對照3.7 5±1.0 5 a 1.6 3±0.8 0 2.1 3±0.4 1 2.4 5±0.3 7 b 空白組0.5 5±0.1 6 a 2.6 9±0.2 7 1.4 9±0.2 4 b

低密度脂蛋白（LDL-C）是人體重要的脂蛋白，可運送膽固醇到全身供細胞利用。但如果血中LDL的濃度過高，則容易在血管壁造成堆積，與纖維蛋白原、血小板、巨噬細胞等發(fā)生作用，形成血管粥狀硬化，阻塞血管。LDL-C即低密度脂蛋白膽固醇，在整個LDL的分子結構中所占的比例相對穩(wěn)定，因此，可以通過LDL-C來判斷LDL的整體水平。LDL-C過高，被視為血管阻塞的危險因子。研究結果表明，小白鼠在注射外源性膽固醇后，LDL-C濃度顯著升高。其中高劑量組、中劑量組、低劑量組均能很好的降低LDL-C水平。

2.6 CPSⅠ對高血脂小鼠HMG-CoA的影響

HMG-CoA還原酶是動物與人體中肝細胞合成膽固醇過程中的限速酶，催化生成甲羥戊酸，抑制HMG-CoA還原酶能阻礙膽固醇合成。表2數(shù)據(jù)表明，與空白組相比，高脂組HMG-CoA還原酶活性下降，這可能是因為外源性膽固醇的增加，反饋抑制膽固醇的合成，從而降低HMG-CoA還原酶活性。同時注射蛋黃乳和CPSⅠ可以極顯著提高HMGCoA還原酶活性。在多糖對照組時，HMG-CoA還原酶活性稍微下降，但不顯著。

2.7 CPSⅠ對高血脂小鼠糞固醇的影響

糞固醇是消化道中未被吸收的膽固醇在結腸被細菌利用，將C-5與C-6間的雙鍵還原生成的產物之一，隨糞排出。表3數(shù)據(jù)表明，與空白組比較，高劑量CPSⅠ注射液能極顯著提高小鼠排出糞固醇的能力，中劑量CPSⅠ和低劑量的CPSⅠ僅促進膽固醇排出的能力略有提升，可能是由于CPSⅠ劑量不足的原因。

表2 CPSⅠ對高血脂小鼠HMG-CoA的影響（n=6，±s）Table 2 Effect of CPSⅠon serum HMG-CoA reductase activity in hyperlipidemia mice（n=6，±s）

表2 CPSⅠ對高血脂小鼠HMG-CoA的影響（n=6，±s）Table 2 Effect of CPSⅠon serum HMG-CoA reductase activity in hyperlipidemia mice（n=6，±s）

注：a為 p＜0.05，b 為 p＜0.01。

處理H M G-C o A 還原酶活性/(μ m o l/（m i n·m g)）高脂組4 4.9 3±2 1.6 2 1 3.3 1±3.8 3 b高劑量組中劑量組多糖對照組2 7.7 4±3.8 5 1 1.9 3±5.5 0 b空白組1 7.8 4±7.1 0 b

表3 CPSⅠ對高血脂小鼠糞固醇的影響（n=6，±s）Table 3 Effect of CPSⅠon coprosterol in hyperlipidemia mice（n=6，±s）

表3 CPSⅠ對高血脂小鼠糞固醇的影響（n=6，±s）Table 3 Effect of CPSⅠon coprosterol in hyperlipidemia mice（n=6，±s）

注：a 為 p＜0.05，b 為 p＜0.01。

處理糞固醇摩爾質量濃度/(μ m o l/g)高劑量組陽性對照1 5.1 1±2.0 1 b 1 3.9 2±3.3 0中劑量組多糖對照組1 2.0 4±5.0 9 1 0.6 2±2.1 8高脂組低劑量組1 0.5 6±2.1 3 9.7 7±2.8 9空白組8.8 0±0.5 7

與高血脂組相比，CPSI處理組小鼠血清TCHO和LDL-C顯著下降，糞固醇摩爾質量濃度升高，但HDL-C和HMG-CoA還原酶活性沒有變化。同時，實驗對硫酸軟骨素與CPSI的降血脂作用進行了比較研究。臨床醫(yī)學證明，硫酸軟骨素可以清除體內血液中的脂質和脂蛋白，清除心臟周圍血管的膽固醇，防治動脈粥樣硬化，并增加脂質和脂肪酸在細胞內的轉換率。比較實驗發(fā)現(xiàn)，CPSI降低小鼠血清T-CHO、LDL-C的能力優(yōu)于或接近硫酸軟骨素降低小鼠血清T-CHO、LDL-C的能力，CPSⅠ提高小鼠排出糞固醇的能力也優(yōu)于或接近硫酸軟骨素的作用能力。因此，CPSI對預防小鼠高血脂有一定療效，每日補充注射CPSI可導致高血脂小鼠血清總膽固醇和LDL膽固醇濃度顯著的降低，其可能在降低心血管疾病風險方面發(fā)揮一定的作用。

一般認為，降低血清膽固醇的機制可能是脂肪和/或膽汁酸吸收障礙，從血液到組織的脂類運輸?shù)臏p少，膽固醇生物合成的內源性抑制和膽固醇分解代謝的增強[10]。

雖然CPSI降脂作用的機制仍不完全明確，但在初步的實驗中發(fā)現(xiàn)CPSI可能導致糞固醇排泄的增加。因此，喂飼高膽固醇飲食小鼠的降脂機制可能在于通過干擾腸道內膽固醇的吸收，增加糞固醇的排泄，抑制外源膽固醇的吸收從而促進體內膽固醇的直接消耗。據(jù)報道，包括藻多糖在內的膳食纖維降低血脂水平主要就是通過在空腸內干擾膽固醇的吸收，在回腸內重吸收膽汁酸，從而增強糞便中膽固醇和膽汁酸的的排泄[11-12]。

3 結語

作者從冷榨油茶籽餅中提取、純化得到了水溶性多糖I（CPSI）。分析發(fā)現(xiàn)，CPSI可能是一種具有多種磷酸基團的復合多糖。毛細管電泳分析結果表明，CPSI由木糖、半乳糖組成，油茶籽CPSⅠ的水解液中半乳糖和木糖的摩爾比為4.6：5.57。

研究表明，油茶籽CPSI具有降低高脂血癥的治療作用，有一定的應用前途。CPSI的配合使用可能是減輕高血脂癥的一種安全有效的方法。CPSI可以開發(fā)作為一種保健食品，廣泛用于高膽固醇血癥患者的輔助治療，但對CPSI作用的代謝機制和生物活性的評估仍需要進一步的研究。

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