適用于黃酒米漿水處理的酵母菌的篩選

孫士勇 ， 曹 鈺 *，2， 陸 健 ，， 蔡國林 ， 馬素梅

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122）

米漿水是黃酒釀造過程中浸米工序的副產(chǎn)物，傳統(tǒng)黃酒釀造，浸米時間比較長，比如傳統(tǒng)的攤飯法釀酒時，浸米時間就長達16～20 d?，F(xiàn)在機械化黃酒生產(chǎn)工藝中一般采用較高的溫度保溫浸米，浸米的時間減少，但是仍需要4～5 d[1]。程斐等使用生物酸化浸米的方法，人工接種乳酸菌進行浸米，快速提高米漿水的酸度，將浸米時間縮短為2 d[2-3]。米漿水中含有十分豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、糖類、有機酸等，其中氨基酸的種類多達18種，還有微量元素、B族維生素和礦物質(zhì)等[4]。米漿水產(chǎn)量非常巨大，生產(chǎn)1 t黃酒大約要產(chǎn)生0.65 t米漿水。2014年我國黃酒產(chǎn)量達到330萬t左右，按照測算總共產(chǎn)生約214.5萬t米漿水。采用厭氧-好氧方式處理米漿水，每噸大約花費2元以上，加上設(shè)備購置和維護費用，米漿水的處理帶來了很大的負擔(dān)，同時也是對營養(yǎng)物質(zhì)的浪費。

目前對米漿水的資源化利用還比較局限，俞關(guān)松等[5]把新鮮的米漿水作為復(fù)制糟香型白酒的投料用水，但受到釀造季節(jié)的約束，有一定的局限性。周高峰等[6]添加75%的米漿水來代替自來水制作黃酒熟麥曲。姜佳麗等[7]考察了用米漿水來替代制曲配料用水制備醬油生產(chǎn)用米曲霉、黑曲霉和紅曲霉的制曲效果。但作為制曲用水，整體消耗量較小。

類胡蘿卜素是一類廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)的脂溶性色素，已被用于藥物、保健食品、飼料和化妝品的生產(chǎn)中[8-12]。類胡蘿卜素對動物和人體具有十分重要的作用，不僅可以作為維生素A的前體[13]，同時還具有很強的抗氧化性，能清除體內(nèi)的自由基[14]，動物和人體內(nèi)的類胡蘿卜素只能從外界獲取[15-16]?？梢援a(chǎn)生類胡蘿卜素的酵母主要有紅酵母屬（Rhodotorula），鎖擲酵母屬（Sporidiobolus），法夫酵母屬（Phaffia），擲孢酵母屬（Sporobolomyces）和紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium）[17-21]。采用酵母生產(chǎn)類胡蘿卜素具有營養(yǎng)要求簡單、發(fā)酵周期短和發(fā)酵條件易于控制等優(yōu)點[22]。

作者在環(huán)境中分離篩選了一株近玫色鎖擲酵母，一方面可以利用米漿水中的營養(yǎng)物質(zhì)，降低米漿水的COD，大大減輕廢水處理壓力，另一方面也可以生產(chǎn)單細胞蛋白（SCP）和類胡蘿卜素，提高了經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/dL，酵母膏10 g/dL，葡萄糖20 g/dL，pH自然；

富集培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/dL，酵母膏10 g/dL，葡萄糖20 g/dL，鏈霉素0.005 g/dL，pH自然；

酸性YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/dL，酵母膏10 g/dL，葡萄糖20 g/dL，調(diào)pH至 3.5；

淀粉培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.5 g/dL，KH2PO40.1 g/dL，NaCl 0.01 g/dL，MgSO4·7H2O 0.05 g/dL，CaCl20.01 g/dL，酵母膏 0.02 g/dL，淀粉 2 g/dL，pH6.5；

乳酸培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.5 g/dL，KH2PO40.1 g/dL，NaCl 0.01 g/dL，MgSO4·7H2O 0.05 g/dL，CaCl20.01 g/dL，酵母膏 0.02 g/dL，用乳酸調(diào) pH 至 3.5～3.7；

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖2 g/dL，蛋白胨1 g/dL，乙酸鈉0.5 g/dL，牛肉膏1 g/dL，檸檬酸氫二銨0.2 g/dL，酵母膏 0.5 g/dL，MgSO4·7H2O 0.058 g/dL，吐溫80 0.1 g/dL，MnSO4·4H2O 0.025 g/dL，K2HPO40.2 g/dL，pH 6.2～6.4。

1.2 生物酸化浸米漿水（BAS）的制備及成分分析

稱取一定質(zhì)量糯米，按1∶1.25的米水比加水，接種植物乳桿菌進行生物酸化浸米，30℃浸漬2 d后，過濾得到生物酸化浸米漿水（BAS，Bio-acidified Seriflux）。測定米漿水的pH、總酸、總糖、淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮、氨態(tài)氮和COD。

1.3 菌株的分離

1.3.1 一級篩選 在學(xué)校及附近生活區(qū)采集水樣、土樣、花草、食品樣本，于富集培養(yǎng)基中富集過夜，涂布于YPD固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2 d，挑取紅色菌落，鏡檢觀察是否為酵母菌。

1.3.2 二級篩選 將第一步篩選到的產(chǎn)色素酵母菌株接種到酸性YPD培養(yǎng)基中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測定培養(yǎng)后的pH、生物量、色素產(chǎn)量，同時將菌液離心后用無菌水洗滌兩次，用等體積無菌水重懸，30℃放置2 h進行饑餓處理，滴加在乳酸平板和淀粉平板上，30℃培養(yǎng)72 h，觀察菌株對乳酸和淀粉的利用情況，綜合考慮，篩選出性能較優(yōu)的菌株。

1.3.3 三級篩選 將上一步篩選的酵母菌株接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基過夜作為種子液，將菌液離心后用無菌水洗滌兩次，用等體積無菌水重懸，以5%的接種體積分數(shù)接種于BAS（裝液量20%）中，30℃，200r/min培養(yǎng)48 h，測定pH、細胞數(shù)、色素產(chǎn)量、COD去除率，選擇綜合性能最優(yōu)的菌株。

1.4 菌株R-70的形態(tài)特征

顯微形態(tài)：挑取酵母菌培養(yǎng)液稀釋一定倍數(shù)，吸取一滴在潔凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，用高倍鏡觀察細胞的形狀、大小和生殖方式。

菌落形態(tài)：將新鮮培養(yǎng)的酵母菌在YPD平板上劃線，30℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落的顏色、質(zhì)地、表面和邊緣形狀等特征。

1.5 菌株R-70的生理學(xué)特征

對酵母菌進行糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化、脲酶試驗和生長溫度試驗，方法參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[23]。

1.6 菌株R-70的分子生物學(xué)鑒定

使用酵母基因組DNA快速抽提試劑盒提取酵母的總DNA， 使用通用引物NL-1 （5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL-4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'） 對菌株 26S rDNA近5'端的D1/D2區(qū)域進行PCR擴增，目標(biāo)產(chǎn)物的長度大約為600 bp，PCR反應(yīng)條件為：94℃變性 1 min，53℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，36個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，回收后純化，由上海生物工程有限公司進行序列測定，根據(jù)測序結(jié)果，在NCBI上用BLASTN對擴增序列進行同源性比較，用MEGA5.0軟件中的Neighbor-Joining分析方法進行分子系統(tǒng)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行1 000次的Bootstraps檢驗。

1.7 菌株R-70在BAS中的生長情況

將篩選的紅酵母接種到經(jīng)過60℃處理30 min的BAS中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)72 h，每隔4小時取樣，血球計數(shù)板法測定細胞數(shù)，R-70菌株的色素為胞內(nèi)色素，使用酸熱法破壁后用丙酮提取色素并測定[24]，離心后烘箱法[25]測定上清液的COD。

1.8 BAS中接種菌株R-70培養(yǎng)后的成分變化

將篩選的紅酵母接種到經(jīng)過60℃處理30 min的BAS中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)72 h，每隔4小時取樣，測定培養(yǎng)液的pH，靛酚藍-分光光度法[26]測定氨態(tài)氮質(zhì)量濃度，測定培養(yǎng)液的還原糖和氨基酸態(tài)氮，測定方法參考國標(biāo)GB/T 13662-2008。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物酸化浸米漿水（BAS）的成分分析

自然浸漬的米漿水受到米種類、產(chǎn)地來源、水溫等多種因素影響，其組成和COD存在差異和波動顯著現(xiàn)象。為保障研究工作的開展，作者采用生物酸化浸米漿水進行實驗。稱取一定質(zhì)量糯米，按1∶1.25的米水比加水，接種植物乳桿菌進行生物酸化浸米，30℃放置2 d后，過濾得到BAS，測定成分，結(jié)果見表1。

表1 BAS的成分分析Table 1 Component analysis of Bio-acidified Seriflux

由表1可以看出，米漿水營養(yǎng)豐富，經(jīng)過生物酸化浸米的米漿水，成分比較穩(wěn)定，有利于后期發(fā)酵過程的穩(wěn)定性。生物酸化浸米得到的米漿水，pH較低，含有一定的淀粉和有機酸，其中有機酸主要為乳酸，約占88.98%，在后期的篩菌過程中，除生長情況和COD降解率外，也考察菌株對淀粉和乳酸的利用情況。

2.2 菌株的篩選

在環(huán)境中分離篩選到108株紅色酵母菌株，測定菌株的生物量、色素產(chǎn)量和色素質(zhì)量分數(shù)，并且考察了各菌株對淀粉和乳酸的利用能力，部分篩選結(jié)果見表2。

表2 二級篩選的部分結(jié)果Table 2 Part of results of secondary screening

R-30可以以乳酸為惟一碳源，R-46、R-50、R-70和R-85菌株的產(chǎn)色素能力較強，選擇這5株相對較優(yōu)的酵母菌株進入下一步篩選。

分別接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h，用無菌水洗滌2次，制備種子液。以5%的接種體積分數(shù)接種于BAS中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)48 h，分別測定培養(yǎng)前后的米漿水各個指標(biāo)，結(jié)果見表3。

R-70菌株對米漿水COD的降解率最高，達到90.38%，色素產(chǎn)量也是最高，達到5.57 mg/L，處理后的發(fā)酵液pH相較于其他四株酵母都要低，為8.41。此外，R-30菌株可以以乳酸為惟一碳源生長，但是其他特性相對較差。綜合考慮，選擇R-70菌株作為利用米漿水的最優(yōu)菌株。

表3 菌株在BAS中的培養(yǎng)篩選結(jié)果Table 3 Results of strain inoculated in BAS

2.3 菌株的形態(tài)特征

R-70菌株菌落呈橘紅色，表面濕潤，邊緣平滑，易挑起。菌體呈橢球形，大小約為（3.0～4.5）μm×（6.0～9.5） μm，以出芽方式進行繁殖，見圖 1。

圖1 R-70菌株的形態(tài)特征Fig.1 Morphological character of R-70

2.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

以通用引物進行PCR擴增，經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳，得到片段長度大約為600 bp的擴增產(chǎn)物，見圖2。

圖2 菌株R-70的26S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR products of 26S rRNA of R-70

回收并純化PCR產(chǎn)物，進行測序。將測得的DNA序列在NCBI上用BLASTN進行同源性比較，用MEGA5.0軟件中的Neighbor-Joining分析方法進行分子系統(tǒng)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 R-70的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain R-70

結(jié)果表明，菌株R-70與Sporidiobolus pararoseusNL8208205的同源性達到97%，親緣關(guān)系最近，由此可初步確定R-70菌株為Sporidiobolus pararoseus（近玫色鎖擲酵母）。

2.5 菌株的的生理學(xué)特征

2.5.1 糖發(fā)酵實驗 參考《酵母菌的特征與鑒定手冊》，對R-70進行了糖的發(fā)酵實驗，結(jié)果見表4。R-70菌株對這幾種糖都不發(fā)酵產(chǎn)氣。

表4 R-70的糖發(fā)酵實驗Table 4 Sugar fermentation tests of R-70

2.5.2 碳氮源同化實驗及其他生理特征 對R-70菌株進行碳源、氮源同化實驗，脲酶試驗和生長溫度試驗，結(jié)果見表5。

表5 R-70的生理生化特征Table 5 Physiological characteristic of R-70

通過比對 《酵母菌的特征與鑒定手冊》，菌株R-70的生理特征鑒定結(jié)果為近玫色鎖擲酵母，與經(jīng)26S rDNA分子鑒定的結(jié)果一致。

2.6 R-70菌株在BAS中的生長情況

將近玫色鎖擲酵母R-70接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，30℃、200r/min培養(yǎng)過夜，作為種子液，用無菌水洗滌兩次，以6%的接種體積分數(shù)接種到經(jīng)過60℃處理30 min的BAS中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)72 h，每隔4小時取樣，測定細胞數(shù)、色素產(chǎn)量、pH，結(jié)果見圖4。

圖4 R-70在米漿水中的生長情況Fig.4 Growth curves of R-70 inoculated in BAS

由圖4可以看出，酵母數(shù)在36 h達到最大，為7.8×107/mL，之后呈緩慢下降趨勢，R-70所產(chǎn)色素主要是類胡蘿卜素，屬于次級代謝產(chǎn)物，36 h開始有一個較快的增加速度，在44 h達到一個較高值5.26 mg/L，之后緩慢增加，72 h的色素產(chǎn)量為5.92 mg/L。米漿水的初始pH為3.68，隨著培養(yǎng)時間的增加，米漿水的pH呈上升趨勢，在28 h左右pH升高速度加快，在44 h左右之后趨于平緩，升高速度變慢，72 h的pH達到8.44，可能與R-70產(chǎn)脲酶有關(guān)，R-70在生長過程中產(chǎn)氨，使pH升高。

2.7 米漿水成分的變化

將R-70菌株接種YPD培養(yǎng)基中，30℃、200r/min培養(yǎng)過夜，作為種子液，用無菌水洗滌兩次，以6%的接種體積分數(shù)接種到經(jīng)過60℃處理30 min的BAS中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)72 h，每隔4小時取樣，8 000 r/min離心5 min，測定上清液中的COD、還原糖和氨態(tài)氮，結(jié)果見圖5。

BAS的初始COD為51 806 mg/L，接種R-70培養(yǎng)后上清液的COD變化見圖5。到44 h達到最低，COD為4 600 mg/L，COD去除率達到91.12%，之后呈升高趨勢。還原糖呈現(xiàn)下降趨勢，40 h下降到一個較低值，之后基本保持不變。上清液中氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的變化與R-70菌株產(chǎn)脲酶有關(guān)，在前期質(zhì)量濃度較低，隨著培養(yǎng)時間的延長而緩慢增加，40 h左右之后增加速度加快，72 h的氨態(tài)氮質(zhì)量濃度為1.45 g/L，R-70在發(fā)酵過程中產(chǎn)氨的量可以將米漿水中的乳酸中和并且氨過量，使發(fā)酵液呈堿性。

圖5 BAS發(fā)酵后上清液成分的變化情況Fig.5 Change of composition in BAS supernatant

3 結(jié) 語

黃酒生產(chǎn)中的浸米漿水產(chǎn)量大，營養(yǎng)物質(zhì)豐富。從環(huán)境中篩選到一株紅色酵母R-70，經(jīng)過26S rDNA分子鑒定，確定該酵母為近玫色鎖擲酵母，在米漿水中培養(yǎng)，可以有效地降解米漿水的COD，減輕廢水處理的壓力，而且可以產(chǎn)生高附加值的單細胞蛋白和類胡蘿卜素，具有良好的應(yīng)用價值。

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