響應面優(yōu)化重組大腸桿菌表達RGD-TRAIL發(fā)酵工藝

曹家明， 韋利軍*， 劉福松

（1.常州千紅生化制藥股份有限公司，江蘇 常州213022；2.中國藥科大學 生命科學與技術學院，江蘇 南京210009）

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF related apoptosis-induced ligand，TRAIL）是 Wiley 等[1]于1995年發(fā)現并克隆的TNF家族成員，其廣泛表達于胸腺、肝臟、胎盤、外周血淋巴細胞等多種組織中[2]。TRAIL可選擇性地誘導乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、結腸癌、淋巴癌以及中樞神經系統(tǒng)腫瘤等腫瘤細胞凋亡，而對正常組織和細胞沒有明顯毒性效應[3-4]。體內實驗表明，TRAIL能引起移植入鼠和猿猴體內的腫瘤消失或顯著地抑制腫瘤生長[5-6]。目前，TRAIL已成為特異性殺傷腫瘤細胞的研究熱點，有望成為潛在的抗腫瘤藥物。

整合素是一類細胞粘附受體家族蛋白，在骨肉瘤、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞表面有高水平的表達[7]。研究表明，該蛋白質與腫瘤細胞生長、分化、轉移、凋亡密切相關[8]，而RGD肽（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）能夠與整合素專一性結合，活化凋亡前體蛋白，從而介導腫瘤血管內皮細胞凋亡[8-9]。Arap等[10]將RGD同阿霉素結合，發(fā)現新的化合物對移植裸鼠體內的人乳腺癌細胞作用增強，毒性降低。因此，將誘導腫瘤細胞凋亡的TRAIL和對腫瘤細胞具有靶向性的RGD結合，可以將治療效應的分子靶向腫瘤部位，將會具有更好的抗腫瘤活性和更低的毒副作用[8]。

響應面法優(yōu)化能以較少的實驗次數對多個實驗因素及其相互影響進行考察和評價，從而快速有效地確定最優(yōu)條件[11]。目前響應面法已廣泛用于培養(yǎng)基、酶催化和發(fā)酵過程的優(yōu)化[12-14]。作者采用響應面分析法對影響RGD-TRAIL發(fā)酵的4個主要因素：接種體積分數、pH值、誘導溫度和誘導時間進行了優(yōu)化，旨在提高RGD-TRAIL表達量，為放大生產提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

重組大腸桿菌RT，宿主菌E.coli BL21（DE3），載體pET28a，卡那霉素抗性：作者所在公司保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基 （g/L） 蛋白胨 10；酵母粉 5；NaCl 10。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨 12；酵母粉 24；三水磷酸氫二鉀16.4；磷酸二氫鉀2.31；甘油5；體積分數0.1%的1 000×卡那霉素。

1.3 儀器與設備

BSC-1600IIA2型生物安全柜：蘇州安泰空氣技術有限公司；ZQPZ-228型組合式振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；MINI-PROTEAN Tetra Cell型電泳儀，Universal hoA560Ⅱ型凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 種子培養(yǎng) 從抗性平板挑取重組大腸桿菌單克隆接入盛有5 mL LB培養(yǎng)基的試管中，37℃、200r/min培養(yǎng)12 h后得一級種子液。按0.1%的接種體積分數將一級種子液接入盛有含30 mL LB培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，37℃、200r/min培養(yǎng)12 h后得二級種子液。

1.4.2 菌種發(fā)酵 將二級種子液按一定的接種體積分數分別接入不同pH值的150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)6 h后降溫到25℃，添加終濃度為0.8 mmol/L的IPTG進行誘導，誘導一定時間后結束發(fā)酵。

1.4.3 RGD-TRAIL表達量檢測 取相當于 OD600=1的菌液1 mL，冰浴中超聲破碎，破碎液10 000 r/min離心3 min，所得上清液和4×SDS上樣緩沖液按體積比3∶1混合后沸煮5 min，然后進行SDS-PAGE（15 g/dL 的分離膠，上樣 10 μL），分離膠采用凝膠成像系統(tǒng)進行掃描，Qscan Demo軟件計算RGDTRAIL表達量。實驗過程中采用破壁離心上清液進行電泳檢測，離心過程已經去除包涵體，因此，電泳檢測結果均為可溶性RGD-TRAIL。

1.5 試驗方法設計

1.5.1 單因素試驗 利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產RGD-TRAIL，對其發(fā)酵工藝中的接種體積分數（3%、6%、9%、12%、15%）， 發(fā)酵液初始 pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）和誘導時間（4、8、12、16、20 h）進行單因素考察，每個實驗重復3次。

1.5.2 響應面優(yōu)化 通過單因素得到的結果，采用Box-Behnken實驗設計對其發(fā)酵工藝進行響應面優(yōu)化，實驗重復3次。

1.5.3 數據分析方法 利用Origin 8.0進行數據處理，Design Export 8.0.5進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 接種體積分數對RGD-TRAIL表達的影響接種體積分數大小直接影響發(fā)酵周期，接種體積分數較大時種子液中較多的胞外水解酶有利于營養(yǎng)物質的利用，從而縮短發(fā)酵周期，提高RGD-TRAIL表達量，同時減少了雜菌生長的機會；接種體積分數過大時菌種生長過快，導致發(fā)酵液粘度增加，溶氧降低，菌體過早進入衰亡期，蛋白質表達量下降[15]。按1.4.2的實驗方法，分別按3%、6%、9%、12%、15%的接種體積分數將種子液接種于pH 7.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，誘導16 h結束發(fā)酵，考察不同接種體積分數對RGD-TRAIL表達的影響，結果見圖1。從圖1可以看出，隨著接種體積分數的增大，RGD-TRAIL表達量逐漸增加，當接種體積分數為9%時，RGDTRAIL表達量最高，繼續(xù)增加接種體積分數，RGDTRAIL表達量出現緩慢下降。因此，選擇9%的接種體積分數最有利于RGD-TRAIL表達。

圖1 接種體積分數對RGD-TRAIL表達的影響Fig.1 Effects of inoculation volume on RGD-TRAIL expression

2.1.2 pH值對RGD-TRAIL表達的影響 pH值的變化會引起多種酶活性的改變，影響菌體對底物的吸收利用，從而影響菌體的生長和目的蛋白質的合成[15]。按1.4.2試驗方法，接種體積分數采用9%，將種子液接種于 pH 值分別為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，誘導16 h結束發(fā)酵，考察不同pH值對RGD-TRAIL表達的影響，結果見圖2。從圖2可以看出，不同pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基中均能表達 RGD-TRAIL，pH值 7.0～7.5時 RGD-TRAIL表達量較高，而pH值為7.0時RGD-TRAIL表達量最高，達到11.86%，因此，選擇pH 7.0作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳pH值。

2.1.3 誘導時間對RGD-TRAIL表達的影響 誘導時間的長短影響目的蛋白的表達量，從而對發(fā)酵產生重要影響。按1.4.2的實驗方法，接種體積分數采用9%，發(fā)酵培養(yǎng)基pH值調節(jié)為7.0，誘導20 h結束發(fā)酵，分別于誘導 4、8、12、16、20 h 時取樣，考察誘導時間對RGD-TRAIL表達的影響，結果見圖3。從圖3可以看出，隨著誘導時間的增加，RGDTRAIL表達量迅速增加，誘導12 h時，RGD-TRAIL表達量達到最大值（12.33%）；隨后RGD-TRAIL表達量開始緩慢下降。因此，誘導時間選擇12 h最佳。

圖2 pH值對RGD-TRAIL發(fā)酵工藝的影響Fig.2 Effects of pH on RGD-TRAIL expression

圖3 誘導時間對RGD-TRAIL發(fā)酵工藝的影響Fig.3 Effects of induction time on RGD-TRAIL expression

2.2 可溶性RGD-TRAIL發(fā)酵中心組合試驗設計及響應優(yōu)化分析

2.2.1 因素與水平的確定 通過誘導溫度和誘導劑濃度對RGD-TRAIL表達量的影響研究[16]，發(fā)現誘導溫度對RGD-TRAIL表達影響較大，25℃誘導時可RGD-TRAIL表達量最高。結合2.1中單因素試驗結果，采用Box-Behnken中心組合試驗設計，以誘導溫度25℃、接種體積分數9%、pH 7.0，誘導時間12 h為中心點，以RGD-TRAIL表達量為響應值，進行四因素三水平實驗設計，實驗方案見表1。

2.2.2 Box-Behnken實驗結果 實驗共27組實驗，實驗號1～24為析因試驗，實驗號25～27為中心點試驗，實驗結果見表2。

表1 各因素水平與取值Table 1 Factors and levels of variances

表2 Box-Behnken試驗設計方案及結果Table 2 Design and values of Box-Behnken experiments

2.2.3 模型的建立及方差分析 應用Design Export軟件對響應值和各因素進行回歸擬合，得到重組大腸桿菌發(fā)酵表達RGD-TRAIL的二次回歸方程：

Y=-1569.30+24.60A+467.24B-6.63C-2.98D+1.75AB+0.28AC+0.23AD+0.50BC+0.25BD+0.24CD-2.87A2-36.64B2-0.23C2-0.08D2

以RGD-TRAIL表達量為響應值，根據表2實驗結果，應用Design Export軟件對模型進行回歸分析，結果見表3。

表3 實驗結果回歸分析Table 3 Regression analysis of experiment results

從表3可以看出，回歸模型p＜0.000 1，失擬項p＞0.05值不顯著，說明構建的模型和真實值之間能夠較好地擬合。該模型決定系數R2=0.973 5，表明該模型可以解釋響應面中97.35%的可變性。模型中自變量 B、C、D、CD、A2、B2的 P 值達到了極顯著的水平，說明pH、誘導溫度、誘導時間及誘導溫度和誘導時間的交互作用對RGD-TRAIL發(fā)酵工藝的影響最為顯著，且各影響因素和影響值之間不是線性關系。

2.2.4 響應面及等高線分析結果 對構建的回歸模型進行響應面分析，考察了各因素間交互作用與響應值之間的響應曲面圖，結果見圖4。從圖4可以看出：因素C與因素D的交互作用曲面最為陡峭，且等高線呈橢圓，表明誘導溫度和誘導時間交互作用對RGD-TRAIL發(fā)酵工藝影響比較顯著，這與表3中回歸分析結果是一致的。

對回歸方程進行偏導求解，得出重組大腸桿菌表達RGD-TRAIL最佳發(fā)酵條件為：接種體積分數7.88%，pH值7.02，誘導時間10.25 h，誘導溫度22℃，此時RGD-TRAIL表達量的預測值達到最大，為17.31%。

2.2.5 驗證實驗 為檢驗試驗的可靠性，采用上述最優(yōu)發(fā)酵條件進行了3次RGD-TRAIL發(fā)酵驗證試驗，得到RGD-TRAIL的表達量為17.27±0.76%，與模型預測值接近，證明該模型描述RGD-TRAIL發(fā)酵工藝是可行的。

圖4 各因素交互效應對RGD-TRAIL表達量的響應面圖Fig.4 Response surface curve of RGD-TRAIL affected by two-factor interactions

3 結語

目前，腫瘤已經成為嚴重威脅人類健康的常見疾病。2014年世界衛(wèi)生組織癌癥報告稱，2012年全球新增癌癥病例1 400萬，預計到2035年全球將新增2 200萬的癌癥病例。艾美仕（IMS）公司預測，2018年全球抗腫瘤藥物市場規(guī)模將達到1 000億美元。蛋白類抗腫瘤藥物由于具有高效低毒，避免放化療的副作用而成為了各大制藥公司近年來的研發(fā)熱點。

TRAIL特異性的誘導腫瘤細胞凋亡而對正常細胞無毒性的獨特優(yōu)勢，使其成為抗腫瘤藥物中潛在的“重磅炸彈”。目前基因泰克正在進行II期臨床試驗，上海恰爾生物技術有限公司已經獲批進行III期臨床試驗，上海歌佰德生物技術有限公司已經完成III期臨床研究，人福藥業(yè)也已獲批進行II、III期臨床試驗，然后由于缺乏腫瘤選擇性，大劑量的TRAIL可引起肝毒性、過敏性毒性等副作用。為了降低TRAIL的毒副作用，我公司同南京大學合作，針對腫瘤新手微血管上的 αvβ3/αvβ5整合素開發(fā)了具有靶向性的一類抗腫瘤新藥RGD-TRAIL。由于RGD肽的靶向作用，更多的重組蛋白和死亡受體結合，激活凋亡通路，使RGD-TRAIL具有更強的抗腫瘤活性和更低的毒副作用。體外實驗表明RGDTRAIL 對 COLO205（結腸癌）、A-673（骨癌）、NCIH358（非小細胞肺癌）等腫瘤細胞最為敏感，其IC50值皆小于0.05 μg/mL；體內動物實驗表明，RGDTRAIL具有良好的抗腫瘤活性，等效劑量是TRAIL的五分之一。

大腸桿菌由于結構簡單、遺傳背景清晰、生長周期短而廣泛用于重組蛋白的表達系統(tǒng)。外源基因在大腸桿菌中的表達不僅受載體、啟動子和目的基因的影響，而且和重組菌的培養(yǎng)條件息息相關。RGD-TRAIL表達過程中由于出現蛋白質的非正確折疊而形成包涵體，因此，進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化來提高RGD-TRAIL表達量（可溶性）有著重要意義。而響應面分析法作為一種優(yōu)化方法，可以在更廣泛的范圍考慮因素的組合，優(yōu)化發(fā)酵條件，預測響應值，使工程菌在最佳的發(fā)酵條件中生長繁殖，進而獲得較多的目的蛋白。

前期研究發(fā)現接種體積分數、pH值、誘導溫度、誘導時間等培養(yǎng)條件對RGD-TRAIL的積累均產生重要影響。響應面實驗結果回歸分析發(fā)現，pH值、誘導溫度、誘導時間的P值均達到極顯著水平，這和預實驗的結果是一致的。pH值不僅可以影響工程菌對營養(yǎng)物質的吸收，而且影響多種酶的活性。誘導溫度對目的蛋白的表達十分關鍵，誘導溫度較高時目的蛋白來不及正確折疊而形成大量包涵體，給后續(xù)分離帶來困難，而且會增加質粒的不穩(wěn)定性；誘導溫度過低時抑制工程菌生長，導致RGD-TRAIL產量降低。誘導時間是影響目的蛋白產量的又一重要因素，誘導時間過短，RGD-TRAIL合成量少；誘導時間過長，營養(yǎng)物質消耗殆盡，有害物質積累導致重組菌的負擔過重，造成目的蛋白降解?；貧w分析同時發(fā)現，誘導溫度和時間之間存在相互影響，借助響應面圖可以看出等高線呈現橢圓形，表明這兩個因素相互作用極其顯著，等高線中最小橢圓的中心點即使響應面的最高點。通過對回歸方程的求解，得到RGD-TRAIL最佳酵工藝條件為：接種體積分數7.88%，pH值7.02，誘導時間10.25 h，誘導溫度22℃。在此最佳發(fā)酵條件下RGD-TRAIL的理論表達量為17.31%。在驗證實驗中RGD-TRAIL的表達量為17.27%，較優(yōu)化前提高了40.06%。本研究為RGD-TRAIL的生產奠定了基礎。

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