血紅密孔菌Pycnoporus sanguineus SYBC-L10產(chǎn)纖維二糖脫氫酶的發(fā)酵優(yōu)化

馮圓圓， 唐明月， 管政兵， 蔡宇杰， 廖祥儒

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇 無錫214122）

纖維二糖脫氫（Cellobiose Dehydrogenase，CDH）可由降解木質(zhì)素和纖維素的真菌產(chǎn)生，主要的生產(chǎn)者是擔(dān)子菌中的白腐菌[1]。大量研究表明[2-6]，白腐菌對纖維素有良好的降解效果。但是從自然界分離、篩選出的天然菌株往往產(chǎn)酶能力較低，因此有必要對其產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，通過優(yōu)化提高酶的產(chǎn)量[7]。

CDH的相對分子質(zhì)量大約為90 000，其中10 000為糖基，80 000為氨基酸，其中糖基中的糖多為甘露糖[8]。CDH是一個黃素血紅素蛋白，含有兩個獨(dú)立的基團(tuán)：黃素基團(tuán)和血紅素基團(tuán)。黃素基團(tuán)含有焦磷酸化酶即FAD；血紅素基團(tuán)含細(xì)胞色素b。兩個基團(tuán)通過15個氨基酸相連。CDH是一種對pH值和溫度穩(wěn)定的酶。室溫下，在pH 3～10的范圍內(nèi)24 h活力穩(wěn)定。CDH可以氧化纖維二糖、纖維寡糖和纖維素。纖維二糖失去兩個電子被氧化的同時，CDH的FAD部分被還原。鐵血紅素基團(tuán)得到一個電子生成亞鐵血紅素和黃素基。得到電子的CDH可以還原多種電子受體，如細(xì)胞色素c、二氯酚靛酚、Fe3+和氧氣。

CDH可增強(qiáng)纖維素酶對纖維素的水解作用[9]，由于酶產(chǎn)生的羥基可分解纖維素的微晶格從而分裂纖維素。CDH可還原木質(zhì)素降解中產(chǎn)生的苯氧基，由此阻止木質(zhì)素的重聚合[10]。CDH可減少纖維素酶的產(chǎn)物抑制作用。纖維二糖抑制降解木質(zhì)素的白腐菌產(chǎn)生的纖維素酶，但是CDH催化纖維二糖所產(chǎn)生的纖維二糖內(nèi)酯對纖維素酶并不產(chǎn)生抑制，所以培養(yǎng)基中加入較低濃度的CDH可幫助纖維素酶降解纖維素，加速纖維素的降解速率，但是高濃度的CDH對纖維素的降解有抑制作用[9]。CDH還可以防止纖維素的重聚合。加速纖維素的降解。在漆酶或者過氧化物酶的輔助下，CDH可連續(xù)催化乳糖產(chǎn)生乳糖酸，乳糖酸是一種高附加值的有機(jī)酸[11]。

作者所在實(shí)驗室從江蘇無錫惠山的朽木上篩選出一株能較好的產(chǎn)CDH的菌株，即Pycnoporus sanguineusSYBC-L10，并初步研究了其產(chǎn)CDH所需要的產(chǎn)酶培養(yǎng)基的條件，為今后的研究和工業(yè)應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

菌株P(guān)ycnoporus sanguineusSYBC-L10：作者所在實(shí)驗室保藏菌種。

1.2 主要材料及試劑

黃豆粉：將黃豆直接磨成粉狀，黃豆購于江蘇無錫歐尚超市；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

1） PDA 培養(yǎng)基（g/L）：新鮮土豆 200，葡萄糖20，瓊脂 20；pH 自然。

2）PDA 液態(tài)培養(yǎng)基（g/L）：新鮮土豆 200，葡萄糖20；pH自然。

3）液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（L）：纖維二糖5 g，酵母膏0.1 g，磷酸氫二銨6 g，磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂0.3 g，氯化鈣0.08 g，七水硫酸鋅5 mg，四水硫酸錳1.5 mg，六水氯化鈷1.5 mg，七水硫酸亞鐵5 mg，VB11.5 mg[12]。

以上培養(yǎng)基均在115℃高溫滅菌20 min。

1.4 種子液的制備

將培養(yǎng)3 d的PDA斜面用無菌水將血紅密孔菌孢子洗下轉(zhuǎn)到事先滅菌的裝有玻璃珠的三角瓶中，在搖床上振搖30 min，然后配制成106個/mL的孢子懸浮液。將孢子懸液以體積分?jǐn)?shù)4%接種于PDA液態(tài)培養(yǎng)基中，在30℃、200r/min條件下培養(yǎng)2 d，得到種子液[13]。

1.5 粗酶液的制備

將生長好的種子液以體積分?jǐn)?shù)10%接種于液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d，得到含酶的發(fā)酵液。將發(fā)酵液用冷凍離心機(jī)以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min，得到的上清液即為粗酶液[14]。

1.6 纖維二糖脫氫酶活力的測定方法

反應(yīng)體系5 mL，包括纖維二糖（2 mmol/L）0.5 mL，DCIP（0.2 mmol/L）0.5 mL，氟化鈉（4 mmol/L）50 μL，乙酸-乙酸鈉緩沖溶液 （100 mmol/L，pH 4.5）2.25 mL，在520 nm處測定OD吸收值。以1 min內(nèi)還原1 μmol DCIP所需要的酶量定義為1個酶活力單位（U），ε520nm=6.8 L/（mmol·cm）[8]。

1.7 Pycnoporus sanguineus SYBC-L10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CDH條件優(yōu)化

將培養(yǎng)好的種子液以體積分?jǐn)?shù)10%接種至液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵條件為：溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，裝液量為50 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶，發(fā)酵周期為7 d。

1.7.1 不同碳源對L10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CDH的影響分別以不同的碳源（葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、馬鈴薯淀粉、微晶纖維素、玉米粉、麩皮、木屑、甘蔗渣）替代液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中纖維二糖，其他條件固定，提取粗酶液測并測定CDH酶活力。

1.7.2 微晶纖維素與葡萄糖質(zhì)量比對L10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CDH的影響 微晶纖維素與葡萄糖之比分別以不同的比例（0∶10、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、10∶0）添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，探究復(fù)合碳源對L10發(fā)酵產(chǎn)CDH的影響，替他條件不變，提取粗酶液并測定CDH酶活力[15]。

1.7.3 不同有機(jī)氮源對L10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CDH的影響 分別以不同的有機(jī)氮源（胰蛋白胨、魚粉蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉、黃豆粉、豆粕）替代液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的酵母膏，其他條件不變，提取粗酶液并測定CDH酶活力。

1.7.4 黃豆粉質(zhì)量濃度對L10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CDH的影響 分別添加不同質(zhì)量濃度的黃豆粉（1、2、4、6、8、10、12 g/L）至碳源優(yōu)化后的培養(yǎng)基，提取粗酶液并測定CDH酶活力。

1.7.5 不同無機(jī)氮源對L10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CDH的影響 分別以不同的無機(jī)氮源（氯化銨、過硫酸銨、酒石酸銨、硫酸亞鐵銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、硫酸銨、硝酸鎂、硝酸鈣、尿素、硝酸鐵）替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸氫二銨，對照為不加無機(jī)氮源，提取粗酶液并測定CDH酶活力。

1.7.6 磷酸氫二銨的質(zhì)量濃度對L10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CDH的影響 在碳源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別添加不同質(zhì)量濃度的磷酸氫二銨（2、4、6、8、10、12、14 g/L）至培養(yǎng)基中，提取粗酶液并測定CDH酶活力。

1.7.7 最優(yōu)碳氮源質(zhì)量濃度組合的正交實(shí)驗設(shè)計確定發(fā)酵培養(yǎng)基中碳氮源的種類和濃度后，利用正交實(shí)驗確定最優(yōu)的碳氮源組合。實(shí)驗的設(shè)計、數(shù)據(jù)結(jié)果分析利用軟件JMP完成，見表1。

表1 正交試驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與討論

2.1 Pycnoporus sanguineus SYBC-L10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CDH條件優(yōu)化

2.1.1 碳源對Pycnoporus sanguineusSYBC-L10產(chǎn)CDH的影響 碳源是微生物生長過程中需求量最大的營養(yǎng)物質(zhì)，不僅為微生物的生理活動提供能量還是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物的主要構(gòu)成組分。各種小分子碳源和大分子碳源對Pycnoporus sanguineusSYBC-L10產(chǎn)CDH的影響結(jié)果見圖1。

圖1 碳源對Pycnoporus sanguineus SYBC-L10產(chǎn)CDH的影響Fig.1 Effect of carbon sources on CDH production by Pycnoporus sanguineus SYBC-L10

對于Pycnoporus sanguineusSYBC-L10而言，不同碳源對其產(chǎn)酶的影響差異顯著（p＜0.05）；其中以微晶纖維素為碳源時，CDH的產(chǎn)量最高，因此選用微晶纖維素為發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的大分子碳源。其中酶活幾乎為零的麩皮、木屑在圖中沒有顯示。

L10單獨(dú)以小分子糖類為碳源時其菌體生長良好，但是在一些大分子多聚物如微晶纖維素中生長不良，菌體量少。在培養(yǎng)基中添加一些小分子糖類如葡萄糖，可以先被菌體吸收，促進(jìn)其快速生長，等菌體長到一定的程度在利用大分子的糖類碳源，這樣有利于增加CDH產(chǎn)量。所以，擬進(jìn)一步考察大分子和小分子復(fù)合碳源對CDH合成的影響。

在小分子糖類中以葡萄糖為碳源時產(chǎn)酶量最高，并且相對其它小分子糖類來說，葡萄糖物美價廉，容易獲得，因此作者以葡萄糖作為CDH發(fā)酵的小分子碳源，研究與微晶纖維素作為復(fù)合碳源對菌體產(chǎn)CDH的影響。圖2顯示，微晶纖維素與葡萄糖質(zhì)量比為1∶1時有利于產(chǎn)酶，CDH酶活力明顯高于單一碳源。

圖2 微晶纖維素與葡萄糖質(zhì)量比對Pycnoporus sanguineus SYBC-L10產(chǎn)CDH的影響Fig.2 Effect of cellulose microcrystalline to D-glucose ratio on CDH production by Pycnoporus sanguineus SYBC-L10

2.1.2 有機(jī)氮源對Pycnoporus sanguineusSYBCL10產(chǎn)CDH的影響 氮源不僅是構(gòu)成菌體細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)等重要物質(zhì)的營養(yǎng)來源，同時還是代謝產(chǎn)物中氮元素的主要來源。氮源主要包括有機(jī)氮源和無機(jī)氮源兩種。不同的有機(jī)氮源對Pycnoporus sanguineusSYBC-L10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CDH的影響見圖3。

從圖3可以看出，以黃豆粉為有機(jī)氮源時，發(fā)酵液中CDH酶活最高可達(dá)到500多個酶活單位，酵母粉、蛋白胨、豆粕與其相比，酶活力明顯偏低。以黃豆粉為氮源時CDH酶活顯著提高（p＜0.05），這可能與黃豆粉中富含的營養(yǎng)成分有關(guān)，黃豆粉中富含蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，既可以滿足菌體生長的需要，又因為CDH為細(xì)胞周質(zhì)酶，黃豆中的脂質(zhì)可改變細(xì)胞膜的通透性，提高發(fā)酵液中CDH的產(chǎn)量，從而提高菌體的產(chǎn)酶量。

圖3 有機(jī)氮源對Pycnoporus sanguineus SYBC-L10產(chǎn)CDH的影響Fig.3 Effect of Organic nitrogen sources on CDH production by Pycnoporus sanguineus SYBC-L10

本研究確定有機(jī)氮源為黃豆粉，考察黃豆粉不同質(zhì)量濃度（1、2、4、6、8、10、12 g/L）下對Pycnoporus sanguineusSYBC-L10產(chǎn)CDH的影響。如圖4所示，隨著黃豆粉的變化，CDH的產(chǎn)量明顯升高 （p＜0.05），當(dāng)黃豆粉在培養(yǎng)基的終質(zhì)量濃度為4 g/L時，此時CDH達(dá)到最大，最有利于CDH合成，此質(zhì)量濃度下CDH的產(chǎn)量為570 U/L。隨著黃豆粉質(zhì)量濃度的增大，CDH的產(chǎn)量下降明顯。所以黃豆粉的質(zhì)量濃度為4 g/L，在此質(zhì)量濃度下最有利于產(chǎn)酶。

圖4 黃豆粉質(zhì)量濃度對Pycnoporus sanguineus SYBCL10產(chǎn)CDH的影響Fig.4 Effect of soybean meal on CDH production by Pycnoporus sanguineus SYBC-L10

2.1.3 無機(jī)氮源對Pycnoporus sanguineusSYBCL10產(chǎn)CDH的影響 由于微生物可以快速利用無機(jī)氮源，促進(jìn)菌體的生長，而有機(jī)氮源含有菌體必需的生長因子為氨基酸發(fā)酵提供前體物質(zhì)及輔酶，所以在以上優(yōu)化的基礎(chǔ)上，研究不同無機(jī)氮源對Pycnoporus sanguineusSYBC-L10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CDH的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 無機(jī)氮源對Pycnoporus sanguineus SYBC-L10產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of inorganic nitrogen sources on CDH production by Pycnoporus sanguineus SYBC-L10

由圖5可知，磷酸氫二銨和硝酸銨對Pycnoporus sanguineusSYBC-L10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CDH有促進(jìn)作用，其中磷酸氫二銨的促進(jìn)作用較為明顯，而氯化銨、檸檬酸銨、磷酸二氫銨對菌體產(chǎn)酶影響不明顯，而硫酸銨和尿素對菌體產(chǎn)酶的抑制作用較明顯，所以選擇磷酸氫二銨為液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的無機(jī)氮源。

確定無機(jī)氮源為磷酸氫二銨，考察磷酸氫二銨的質(zhì)量濃度（2、4、6、8、10、12、14 g/L）對Pycnoporus sanguineusSYBC-L10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CDH的影響，結(jié)果見圖6。當(dāng)磷酸氫二銨的質(zhì)量濃度增大時，CDH的產(chǎn)量也隨之增大，并且在磷酸氫二銨的質(zhì)量濃度為6 g/L時，此時CDH的產(chǎn)量達(dá)到最大；之后磷酸氫二銨的質(zhì)量濃度增大，CDH的產(chǎn)量降低，說明高質(zhì)量濃度的磷酸氫二銨不利于CDH的積累。因此磷酸氫二銨的質(zhì)量濃度為6 g/L，此時產(chǎn)酶量最高可達(dá)到700 U/L。

圖6 磷酸氫二銨質(zhì)量濃度對Pycnoporus sanguineus SYBC-L10產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of （NH4）2HPO4on CDH production by Pycnoporus sanguineus SYBC-L10

2.1.3 最優(yōu)碳氮源濃度組合的正交實(shí)驗設(shè)計 根據(jù)上述實(shí)驗結(jié)果，4個組分分別設(shè)定4個質(zhì)量濃度，采用L16（45）正交試驗設(shè)計研究不同質(zhì)量濃度的碳源和氮源組成對CDH合成的影響，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 L16（45）正交實(shí)驗結(jié)果及分析Table 2 Result and analysis of the L16（45） orthogonal array design

各因素對CDH發(fā)酵的影響程度排列為C＞B＞A＞D，即黃豆粉對CDH合成的影響最大，可見，黃豆粉是Pycnoporus sanguineusSYBC-L10 CDH液態(tài)發(fā)酵過程中的關(guān)鍵因素，黃豆粉中含有豐富的蛋白質(zhì)和脂類，可為菌體生長和發(fā)酵提供有利的條件，并且黃豆粉中還含有豐富的維生素，可以為菌體合成CDH提供前體物質(zhì)。碳氮源的最佳組合為微晶纖維素7 g/L，葡萄糖5 g/L，黃豆粉6 g/L，磷酸氫二銨2 g/L，在此條件下，CDH的產(chǎn)量最高。為了驗證預(yù)測結(jié)果，利用此條件進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗，得出的CDH酶活為1 245±35.78 U/L，比16個實(shí)驗的實(shí)驗值都高，所以這一實(shí)驗條件即為發(fā)酵產(chǎn)CDH的發(fā)酵條件。

3 結(jié)語

經(jīng)研究確定，Pycnoporus sanguineusSYBC-L10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CDH的發(fā)酵條件的優(yōu)化，經(jīng)過碳源中大分子碳源和小分子碳源的優(yōu)化，使大小分子碳源組合成復(fù)合碳源使菌體產(chǎn)酶提高，經(jīng)過氮源的優(yōu)化，其中包括有機(jī)和無機(jī)氮源的優(yōu)化，進(jìn)一步提高了菌體的產(chǎn)酶量，通過優(yōu)化發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在菌體的產(chǎn)酶為1 245±35.78 U/L， 未優(yōu)化時產(chǎn)酶為 39±4.78 U/L，提高了近32倍，已達(dá)到國內(nèi)領(lǐng)先水平[7]。而Pycnoporus sanguineusSYBC-L10液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)CDH的培養(yǎng)條件和CDH的酶學(xué)性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]LIYanni，LIU Junhong.The recent advance on cellobiose dehydrogenase[J].Journal of Chemical Industry of Forest Products，2003，37（2）：26-30.（in Chinese）

[2]HE Xinsheng，YANG Chaohui，ZHAO Chunhua，et，al.Research oflignocelluloses degradation by three white rot fungi[J].Journal of Cellulose science and Technology，2012，20（1）：33-38.（in Chinese）

[3]ZHENG Peng，LI Qinfen，LI Guangyi，et，al.Comparison of cellulose decomposing abilities of eight microbial strains[J].Chinese Journal of Tropical Crops，2012，33（6）：1121-1125.（in Chinese）

[4]LU Shixiang，WANG Qiuyu.Application progressofwhite rotfungiin lignocellulosesdegradation[J].Forest Engineering，2009，25（4）：26-31.（in Chinese）

[5]LIU Wenhua，CAI Yujie，SUN Fubao，et al.Study ofTrametes hirsutaSYBC-L19 liquidstate fermentation for laccase production[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2012，31（12）：1252-1261. （in Chinese）

[6]LIU Kun，LI Huixuan，LI Jing.Studies on the co-culture of white rot fungi for degrading corn stalk[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences，2003，36（4）：1327-1329.（in Chinese）

[7]FANG Jing，LIU Wen，GAO Peiji.Optimization of cellobiose dehydrogenase production by schizophyllum commune and some properties of the enzyme[J].Mycosystema，2000，19（1）：107-110.（in Chinese）

[8]BAMINGER U，SUBRAMANIAMSS，RENGANATHAN V，etal.Purification and characterization ofcellobiose dehydro-genase from the plant pathogenSclerotium（Athelia） rolfsii[J].Applied and Environmental Microbiology，2001，67（4）：1766-1774.

[9]FANG Jing，GAO Peijing.Study on the role of cellobiose dehydrogenase in cellulose degradation[J].Microbiology，2000，27（1）：15-18.（in Chinese）

[10]FANG Jing，LIU Wen，GAO Peijing.Cellobiose dehydrogenase：inhibition of polymerization of pheolic compounds and enhancing lignin degradation by ligninases[J].Acta Biochimica Et Biophysica Sinica，1999，31（4）：415-419.（in Chinese）

[11]ALONSO S，RENDUELES M，DIAZ M.Bio-production of lactobionic acid：current status，applications and future prospects[J].Biotechnology Advances，2013，31（8）：1275-1291.

[12]TEMP U，EGGERT C.Novel interaction between laccase and cellobiose dehydrogenase during pigmentPycnoporus cinnabarinus[J].Applied and Environmental Microbiology，1999，65（2）：389-395.

[13]YUE Cuicui，SHEN Jianzeng，CAI Yujie，et al.Optimization of fermentation conditions for cordycepin byCordyceps militarisJN168[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（2）：135-141.（in Chinese）

[14]FAN Jingjing，MA Deli，LIAO Xiangru，et al.Laccase production under solid-state fermentation of wheat straw and its degradation byPycnoporus sanguineusSYBC-L12[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2015，34（2）：128-133.（in Chinese）