D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的異源表達和酶學性質(zhì)

溫宇威， 張 濤， 沐萬孟， 江 波

（食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3位置上的差向異構(gòu)體，它在自然界中天然存在很少，并且價格昂貴?，F(xiàn)在，越來越多的研究表明了D-阿洛酮糖是一種超低能量的糖。D-阿洛酮糖的甜度為蔗糖的70%，但能量吸收效率僅為蔗糖的0.3%[1-2]，而且它在消化道中幾乎不被吸收[3]。因此，用它作為食品甜味劑在商業(yè)上很有潛力。近來，又有很多的生理研究表明D-阿洛酮糖具有很多生理功能，包括神經(jīng)保護作用[4]、增強胰島素耐受性[5-6]、抗氧化活性[7]、降低血糖和血脂[8-9]等。此外在食品加工過程中，在食品體系中添加D-阿洛酮糖可以起到提高凝膠性的作用，同時它還可以與食品體系中的蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生良好的化學風味[10]。由于D-阿洛酮糖在自然界中的來源很有限，而且化學合成難度大，因而越來越多的研究轉(zhuǎn)向了利用微生物途徑生產(chǎn)D-阿洛酮糖。

D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶家族酶能夠催化己酮糖在C-3位置上發(fā)生差向異構(gòu)化。它能夠以相對便宜的糖為底物生成價格昂貴的糖，例如催化D-塔格糖生成D-山梨糖，催化D-果糖生成D-阿洛酮糖。日本香川大學的Izumori研究團隊于1993年在Pseudomonas cichoriiST-24中發(fā)現(xiàn)了一種可以催化己酮糖C-3位差向異構(gòu)化的酶，命名為D-己酮糖3-差向異構(gòu)酶，因其最適底物為D-塔格糖，后重新命名為D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶[11]。此后，又有很多D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶家族的酶被發(fā)現(xiàn)。2009年，發(fā)現(xiàn)了來自Rhodobacter sphaeroidesSK011的R.sphaeroidesDTEas[12]；2011 年， 發(fā)現(xiàn)了來自Clostridium cellulolyticumH10的C.cellulolyticumDPEase[13]；2013 年，發(fā)現(xiàn)了來自Clostridium scindensATCC 35704 的C.scindensDPEase[14]；2014 年，發(fā)現(xiàn)了來自Clostridium bolteaeATCC BAA-613的C.bolteaeDPEase[15]。上述所報道的這些DTE家族酶都已經(jīng)在大腸桿菌中被克隆表達，酶學性質(zhì)也得到了廣泛的研究。近幾年，陸續(xù)又發(fā)現(xiàn)多種DTE家族酶，目前，對DTE家族酶的研究主要集中于發(fā)現(xiàn)新微生物來源的酶和對其酶學性質(zhì)及晶體結(jié)構(gòu)的探索，而利用DTE家族酶工業(yè)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖卻未見報道。

以大腸桿菌為宿主克隆表達DTE家族酶在工業(yè)應(yīng)用上存在著很多的問題，低表達量、內(nèi)毒素、形成包涵體以及目的蛋白質(zhì)的錯誤折疊都是大腸桿菌表達系統(tǒng)的缺點[16]?？莶菅挎邨U菌作為一種食品級表達宿主，越來越受到人們的青睞，主要有以下幾個方面原因：1）是一種安全的表達系統(tǒng)；2）高效分泌目的蛋白質(zhì)的能力；3）沒有明顯的密碼子偏愛性，同時表達產(chǎn)物也不容易形成包涵體；4）轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊和分泌等信息已經(jīng)被廣泛研究；5）發(fā)酵條件簡單，產(chǎn)物易于分離純化。所有這些優(yōu)勢使得枯草芽孢桿菌成為了工業(yè)上生產(chǎn)酶的細胞工廠。當然，枯草芽孢桿菌作為外源基因的表達宿主也存在一些缺陷，主要包括分泌各種蛋白酶降解外源蛋白質(zhì)和重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性[17]。

在本研究中，我們構(gòu)建了以枯草芽孢桿菌為宿主，雙啟動子表達DTE家族酶的表達系統(tǒng)，以此來提高DTE家族酶的表達量。我們克隆了來源于Clostridium bolteaeATCC BAA-613的DPE基因，并在其上游插入了P43啟動子，然后導入到B.subtilisWB800進行表達，并對重組酶進行了分離純化和酶學性質(zhì)的研究。本研究旨在實現(xiàn)DPE在食品級微生物枯草芽孢桿菌中的高效表達，為工業(yè)化酶法生產(chǎn)D-阿洛酮糖奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

E.coliDH5α和B.subtilisWB800：購于上海生工生物工程有限公司；克隆載體pMD19-T和表達載體pMA5：作者所在實驗室保存；PCR引物：上海生工合成；DNA聚合酶、T4DNA連接酶、Nde I和Bam HI限制性內(nèi)切酶：購自大連寶生物工程有限公司；D-阿洛酮糖標樣：購自Sigma公司；其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 目的基因Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DPE的擴增 基于Cb-dpe和P43啟動子的基因序列，分別設(shè)計相對應(yīng)的上下游引物對它們進行擴增，見表1。其中在P43上游引物P1和Cb-dpe下游引物P4的5’端引入Nde I和Bam HI酶切位點，在重組質(zhì)粒3’端添加了6個組氨酸標簽，方便后面的克隆操作和重組目的蛋白質(zhì)的分離純化。而且，P43的下游引物P2和Cb-dpe的上游引物P3有部分是反向互補的，這樣在重疊延伸PCR的時候能將P43和Cb-dpe連接。

表1 PCR引物的序列Table 1 Oligonucleotides used for PCR

1.2.2 雙啟動子表達載體的構(gòu)建 分別用引物P1、P2擴增出P43啟動子，引物P3、P4擴增出Cb-dpe片段后，根據(jù)重疊延伸PCR的方法，將P43和Cbdpe混在一起作為混合模板，再用引物P1、P4擴增出P43-Cb-dpe片段。將PCR后的產(chǎn)物通過膠回收試劑盒回收并純化目的片段，用T4連接酶將P43-Cb-dpe連接到克隆載體pMD19-T后，得到pMD19-T-P43-Cb-dpe載體，將其導入到E.coli DH5α中對其進行克隆擴增，然后提取質(zhì)粒進行測序驗證。在得到正確的測序結(jié)果后，用NdeI和BamHI雙酶切 pMD19-T-P43-Cb-dpe和 pMA5，回收P43-Cb-dpe后利用T4連接酶將其連接到pMA5上，構(gòu)建出pMA5-P43-Cb-dpe表達載體。最后，將pMA5-P43-Cb-dpe導入到宿主B.subtilisWB800中進行表達。

1.2.3 重組菌株的發(fā)酵培養(yǎng) 對于E.coli DH5α來說，其培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、200r/min。而對于B.subtilis WB800來說，先要在LB培養(yǎng)基中進行12 h的種子液培養(yǎng)，然后以3%的接種體積分數(shù)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)條件和E.coli DH5α的相同。E.coli DH5α的培養(yǎng)基在接種前需加入終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素，而B.subtilis WB800的培養(yǎng)基需加入終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的卡那霉素。

1.2.4 雙啟動子表達載體和單啟動子表達載體的表達水平比較 將雙啟動子表達載體pMA5-P43-Cb-dpe和單啟動子表達載體pMA5-Cb-dpe分別導入到宿主B.subtilis WB800中進行表達，相同條件下培養(yǎng)，在不同的發(fā)酵時間點取樣測定菌體生長情況和酶活進行對比。

1.2.5 重組DPE的分離純化 低溫離心（8 000 g，10 min，4℃）發(fā)酵液收集菌體，然后以緩沖液（100 mmol/L NaCl，50 mmol/L PBS 鈉鹽緩沖液，pH 7.0）重懸菌體，超聲波破碎重組B.subtilis WB800 8 min（300 W，開 1 s/關(guān) 2 s）后，低溫離心（10 000 g，20 min，4℃）后棄去細胞碎片，收集上清液，并將上清液用0.45 μm孔徑的醋酸纖維濾膜過濾，得到粗酶液。由于引入了6個組氨酸標簽，因此采用Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow親和柱對重組酶進行分離純化。

在低溫條件下，預先用5個柱體積去離子水沖洗層析柱，再用3～4個柱體積的Binding Buffer（500 mmol/L NaCl，50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0）平衡層析柱，將粗酶液加入層析柱中，然后用 Wash Buffer（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0）洗去雜蛋白質(zhì)，最后用 Elution Buffer（500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪 唑 ，50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0）洗脫得到酶液。用SDSPAGE電泳對純化后的重組蛋白質(zhì)進行檢驗。

1.2.6 重組Cb-DPE的酶活測定 整個酶反應(yīng)體系為 1 mL，其中 D-果糖 50 g/L，CoCl21 mmol/L，重組酶1 μmol/L，PBS鈉鹽緩沖液 50 mmol/L，反應(yīng) 10 min，然后煮沸5 min終止酶反應(yīng)。

D-阿洛酮糖檢測：將酶反應(yīng)產(chǎn)物低溫離心（4℃，12 000 r/min）30 min，取上清液用 0.22 μm 微濾膜過濾，稀釋后進行HPLC檢測。檢測條件：Agilent 1260型高效液相色譜儀，Waters Sugar-Pak 1鈣型陽離子交換柱，Shodex RI-101型示差折光檢測器，以0.22 μm孔徑的醋酸纖維濾膜過濾的純水作流動相，流速0.4 mL/min，柱溫85℃。

酶活單位U定義：在標準酶反應(yīng)條件下，單位時間內(nèi)酶催化D-果糖產(chǎn)生1 μmol的D-阿洛酮糖所需要的酶量定義為1個酶活單位。

1.2.7 重組Cb-DPE的最適反應(yīng)溫度及其穩(wěn)定性將 1 mL 的酶反應(yīng)體系分別置于 35、40、45、50、55、60、65、70℃條件下，參照1.2.5方法測定各組酶活，確定最適反應(yīng)溫度，并將酶活最高的一組設(shè)為相對酶活100%。

為了研究重組酶的熱穩(wěn)定性，將純化后的酶液，分別在 30、40、50、60 ℃下保溫，每隔半小時取樣，測定殘余酶活，定義初始酶活為相對酶活100%。

1.2.8 重組Cb-DPE的最適反應(yīng)pH及其穩(wěn)定性將 1 mL的酶反應(yīng)體系分別置于 pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0條件下測定各組酶活，確定最適反應(yīng)pH，并將酶活最高的一組設(shè)為相對酶活100%。實驗中用到的兩種不同的緩沖體系：磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.0～7.0）和 Tris-HCl緩沖溶液（pH 7.5～9.0）。

為了研究重組酶的pH穩(wěn)定性，將純化后的酶液分別在 pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 的緩沖液體中，低溫（4℃）保持2 h，測定殘余酶活，定義初始酶活為相對酶活100%。

1.2.9 不同種類金屬離子和金屬離子濃度對酶活的影響 為了研究金屬離子對酶活的影響，首先在在低溫條件下（4℃）將純化好的酶液在透析液中透析6 h，螯合除去酶液中的金屬離子。酶反應(yīng)中添加不同種類的金屬離子 （Co2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Ba2+）至終濃度 1 mmol/L，反應(yīng) 10 min，然后煮沸5 min，終止酶反應(yīng)。測定不同種類金屬離子對酶活的影響，確定最適金屬離子，并將酶活最高的一組設(shè)為相對酶活100%。

經(jīng)試驗確定最適金屬離子后，設(shè)置不同金屬離子濃度的反應(yīng)體系，測定酶活，將酶活最高的一組設(shè)為相對酶活100%。

1.2.10 重組Cb-DPE的反應(yīng)動力學常數(shù)研究 為了研究重組酶的反應(yīng)動力學，分別以 5、7.5、10、15、20、50、100、200mmol/L 的 D-果糖和 D-阿洛酮糖作為底物，測定酶活，通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，計算出重組酶的動力學參數(shù)：Km、Kcat、Kcat/Km。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cb-dpe和P43啟動子的擴增

分別擴增出P43啟動子和Cb-dpe基因后，利用重疊延伸PCR技術(shù)，以P43啟動子和Cb-dpe基因為混合模板，再次利用引物P1和P4，將P43啟動子插入到了Cb-dpe基因的上游，得到了P43-Cbdpe片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在1 200bp處出現(xiàn)了明顯的擴增條帶，見圖1，與預期產(chǎn)物大小吻合。

圖1 P43-Cb-dpe的擴增Fig.1 Agarose gel electrophoresis of P43-Cb-dpe amplification

2.2 雙啟動子表達載體的構(gòu)建

在得到了P43-Cb-dpe片段之后，用T4連接酶將其連接到了pMD19-T載體上，導入到E.coli DH5α中對其進行擴增，然后提取質(zhì)粒進行測序驗證，結(jié)果表明擴增出的P43-Cb-dpe序列正確。之后，用 NdeI和 BamHI對 pMD19-T-P43-Cb-dpe和pMA5載體進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收P43-Cb-dpe目的片段，再次利用T4連接酶將其連接到pMA5載體上，構(gòu)建出pMA5-P43-Cb-dpe表達載體。由于pMA5載體上本身自帶有Hpa II啟動子，因此，我們構(gòu)建的pMA5-P43-Cb-dpe是一個雙啟動子的表達載體。對重組質(zhì)粒進行Nde I和Bam HI的雙酶切，得到pMA5載體的線性片段和插入的P43-Cb-dpe片段。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示的兩個條帶大概分別為7 500 bp和1 200bp，見圖2。與pMA5載體和P43-Cb-dpe大小相符，表明雙啟動子表達載體構(gòu)建成功。最后將pMA5-P43-Cb-dpe導入到宿主B.subtilisWB800進行表達。

圖2 pMA5-P43-Cb-dpe雙酶切驗證電泳圖Fig.2 Identification of pMA5-P43-Cb-dpe by enzyme digestion

2.3 雙啟動子表達載體和單啟動子表達載體的表達對比

與單啟動子表達載體pMA5-Cb-dpe相比，雙啟動子表達載體pMA5-P43-Cb-dpe能夠明顯提高重組菌株的生長量和目的基因Cb-dpe的表達水平，見圖3。在對數(shù)生長后期，雙啟動子表達載體pMA5-P43-Cb-dpe的發(fā)酵酶活為7.63 U/mL，比單啟動子表達載體pMA5-Cb-dpe提高了36%。該結(jié)果表明，雙啟動子能夠促進Cb-dpe在B.subtilis WB800中的高效表達。啟動子是基因表達的重要元件，能夠顯著影響基因的表達。P43是來源于B.subtilis的組成型啟動子，有較高的啟動強度。在該啟動子的調(diào)節(jié)下，目的基因在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期均可穩(wěn)定表達[18]。

圖3 pMA5-P43-Cb-dpe and pMA5-Cb-dpe的表達比較Fig.3 Enzyme activity and growth comparison of pMA5-P43-Cb-dpe and pMA5-Cb-dpe

2.4 重組DPE的分離純化

對上述得到的重組菌株進行發(fā)酵，當菌體濃度達到一定值時離心收集菌體。超聲破碎菌體細胞后再次離心，將得到的上清液過膜得到粗酶液。為了簡化蛋白質(zhì)純化的步驟，我們在重組蛋白的C端引入了6個組氨酸標簽，而組氨酸能夠高度親和Ni2+，因此可以使用Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow親和色譜快速純化目的蛋白質(zhì)。然后將純化后的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳檢驗，結(jié)果見圖4。純化的蛋白質(zhì)大小約為34 000，與理論蛋白質(zhì)相對分子量相吻合，證明了pMA5-P43-Cb-dpe在B.subtilis WB800成功表達。

圖4 純化后Cb-DPE的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant Cb-DPE

2.5 重組Cb-DPE的最適反應(yīng)溫度及其穩(wěn)定性

本研究通過測定在不同溫度下的酶活力，得到了Cb-DPE的酶活——溫度變化曲線，見圖5?？梢钥闯雒富铍S溫度的變化特征非常明顯，隨著溫度的上升，酶活經(jīng)歷了先上升再下降的過程，與之前描述的規(guī)律相符。55℃為該酶的最適溫度，當溫度超過60℃時，酶活急劇下降，在50～60℃之間，其相對酶活仍可維持在90%以上。

溫度對酶促反應(yīng)速率的影響表現(xiàn)在兩個方面：一方面與一般化學反應(yīng)一樣，當溫度升高時，反應(yīng)速率加快；另一方面由于酶是蛋白質(zhì)，隨著溫度升高，酶的變性速度加快，酶會因變性而失活，從而引起了酶反應(yīng)速率的下降。酶反應(yīng)的最適溫度就是這兩種過程平衡的結(jié)果。

圖5 溫度對Cb-DPE酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on Cb-DPE activity

Cb-DPE的熱穩(wěn)定性見圖6?？梢钥闯觯?0℃溫育時，4 h后Cb-DPE的殘余酶活仍然高于80%；40℃溫育時，3 h后Cb-DPE的殘余酶活仍然高于70%，這表明它在30～40℃范圍內(nèi)有良好的穩(wěn)定性；50℃溫育時，Cb-DPE的殘余酶活急劇降低，在2.5 h以后殘余酶活幾乎為零；60℃溫育時，殘余酶活在1 h就已經(jīng)消失。與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌表達的DPE的熱穩(wěn)定性有所提高[15]。

圖6 溫度對Cb-DPE酶穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperature on Cb-DPE stability

2.6 重組Cb-DPE的最適反應(yīng)pH及其穩(wěn)定性

酶的生物學特征之一是它對酸堿的敏感性，這表現(xiàn)在酶的活性和穩(wěn)定性易受環(huán)境pH的影響。pH對酶的活性的影響極為顯著，通常酶只在一定的pH范圍內(nèi)才表現(xiàn)出活性，同一種酶在不同的pH值下所表現(xiàn)的活性不同，其表現(xiàn)活性最高時的pH值稱為酶的最適pH。不同的酶在特定條件下都有它各自的最適pH。

pH對酶活的影響結(jié)果見圖7。可以看出隨著pH的上升，酶活呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在pH 7.0時酶活最高，和大腸桿菌表達的DPE一致[15]。工業(yè)化生產(chǎn)要求酶的最適pH為弱酸性，同時弱酸穩(wěn)定性要強，因為在偏酸性條件下單糖異構(gòu)化過程可以降低非特異性副反應(yīng)以及褐變反應(yīng)。Cb-DPE有較寬的pH作用范圍，但是最適的反應(yīng)pH仍在弱堿性范圍（7.0～7.5），與期望的弱酸性pH范圍仍有一定差距。

Cb-DPE的pH穩(wěn)定性見圖8。中性環(huán)境下，Cb-DPE有良好的pH穩(wěn)定性。在pH 6.5～7.5的緩沖液中保持2 h后，殘余酶活可在90%以上；而在偏酸性或偏堿性環(huán)境下，酶活損失較大。

各種酶因其氨基的組成和構(gòu)象的不同，特別是因其作用中心構(gòu)象和微環(huán)境的特殊性，酶分子只在一定的pH下保持穩(wěn)定。不同的酶其pH穩(wěn)定區(qū)域不同，有的酶只在穩(wěn)定pH范圍內(nèi)的某一個pH區(qū)才有活性，超出了這個pH范圍，酶活力將會大幅度降低。酶在過酸或過堿的環(huán)境中放置時間過長，都會導致不可逆的失活；當在偏酸或偏堿的環(huán)境中放置短暫的時間，雖然酶活力發(fā)生下降，但測定酶活時，在最適pH下測定，活力可以恢復到正常狀態(tài)，這種pH的效應(yīng)僅僅引起酶活性中心及微環(huán)境出現(xiàn)的可逆變化，但不導致整個酶分子構(gòu)象出現(xiàn)不可逆的變化。

圖7 pH對Cb-DPE酶活力的影響Fig.7 Effect of pH on Cb-DPE activity

圖8 pH對Cb-DPE酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on Cb-DPE stability

2.7 不同金屬離子和金屬離子濃度對酶活的影響

金屬離子對酶的作用有兩種，一是作為酶的輔助因子起作用，二是作為激活劑起作用。對于差向異構(gòu)酶來說，金屬離子通常與其活性中心的殘基結(jié)合，具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的作用，是一種重要的輔基。已報道的DTE家族酶均表現(xiàn)出金屬依賴性，只有在金屬離子存在的情況下才有酶活。

不同金屬離子對Cb-DPE酶活的影響見圖9。以純化后未經(jīng)EDTA處理的原始酶為對照，可以看出不同的金屬離子對酶活的影響有顯著的不同，Mg2+和Zn2+對該重組酶的催化活性有明顯抑制作用，而Co2+、Mn2+均呈現(xiàn)對酶催化活性增強的作用。有研究表明，金屬離子在催化過程中能夠錨定底物與酶的結(jié)合以及穩(wěn)定生成的中間體的構(gòu)象[19]。至于為什么只有Co2+和Mn2+對酶活有提高目前尚未得知。

圖9 金屬離子對Cb-DPE酶活力的影響Fig.9 Effect of different metal ions on Cb-DPE activity

由于Co2+的增強作用大于Mn2+，因此進一步考察不同濃度的Co2+對酶活的影響。圖10呈現(xiàn)了Co2+濃度對酶活的影響，當體系中不存在Co2+時，Cb-DPE不表現(xiàn)出催化作用，這說明酶催化反應(yīng)是依靠Co2+的；當在體系中添加Co2+的時候，酶催化反應(yīng)速度急劇上升，并于0.4 mmol/L時達到最高，當Co2+濃度大于1 mmol/L時，隨著Co2+濃度的上升，酶催化反應(yīng)的速度趨于穩(wěn)定。這可能是由于酶和金屬離子的結(jié)合趨于飽和。

圖10 Co2+濃度對Cb-DPE酶活力的影響Fig.10 Effect of Co2+concentration on Cb-DPE activity

2.8 重組酶的反應(yīng)動力學常數(shù)研究

Km是酶的一個特性常數(shù)，其大小只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。Km值可以判斷酶的專一性和對底物的親和性，有的酶可作用于多種底物，每種底物都有對應(yīng)的Km值，其中Km值最小的底物稱為該酶的最適底物。Kcat稱之為催化常數(shù)，是指在底物濃度處于飽和狀態(tài)下，每摩爾酶活性部位每秒鐘轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物的摩爾數(shù)，Kcat值越大，表示酶的催化速率越高。Kcat/Km是指在酶催化作用下，底物生成產(chǎn)物的表觀二級速率常數(shù)，也稱為專一性常數(shù)或催化效率。

重組Cb-DPE的動力學常數(shù)見表2。當以D-阿洛酮糖為底物時，其Km值為26.68 mmol/L，小于以D-果糖為底物時的61.80 mmol/L，這說明該酶對D-阿洛酮糖的親和性更高，最適底物是D-阿洛酮糖；而且以D-阿洛酮糖為底物時，Cb-DPE的催化效率 Kcat/Km為 95.8 L/（mmol·min），大于以果糖作為底物時的 54.1 L/（mmol·min）。

表2 Cb-DPE的底物專一性和動力學常數(shù)Table 2 Relative activities and kinetic parameters of Cb-DPE for different substrates

3 結(jié) 語

擴增了來源于Clostridium bolteaeATCC BAA-613的DPE基因，利用重疊延伸PCR技術(shù)在目的基因上游加入P43啟動子，擴增出P43-Cb-dpe，再將其連接到pMA5載體上成功構(gòu)建出了雙啟動子表達載體pMA5-P43-Cb-dpe，以此來提高目的基因的表達水平。將重組質(zhì)粒導入到食品級表達宿主B.subtilisWB800中進行表達，與單啟動子表達載體相比，雙啟動子表達載體能夠顯著提高Cb-dpe的表達量。對目的蛋白質(zhì)分離純化后研究了其酶學性質(zhì)，結(jié)果表明重組DPE的最適溫度為55℃，最適pH為7.0，在溫度30～40℃范圍內(nèi)和pH 6.5～7.5之間有良好的穩(wěn)定性。Co2+、Mn2+可顯著增強酶活。此外我們還研究了Cb-DPE的底物特異性，發(fā)現(xiàn)該酶對D-阿洛酮糖的親和性比對D-果糖的高。而在動力學參數(shù)方面，以D-阿洛酮糖為底物時，Cb-DPE的催化效率Kcat/Km也更大。重組DPE的酶學性質(zhì)與大腸桿菌表達的DPE相似，這表明DPE在枯草芽孢桿菌中的表達不會改變其酶學性質(zhì)，為DPE食品級表達的工業(yè)化應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

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