產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸釀酒酵母工程菌株的構建

張俊麗 ， 康 振 ， 錢晟東 ， 邱 玲 ， 陳 堅 ， 堵國成 *

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA），作為一種天然存在于細菌、真菌、動物及植物等生物機體活細胞中的非蛋白類氨基酸，是血紅素、葉綠素、維生素B12等吡咯類化合物的關鍵前體物質[1-2]。ALA具有安全、選擇性和滲透性好以及環(huán)境相容性等特點，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學領域應用非常廣泛[3-5]。自然界中主要存在兩條ALA合成途徑，分別是C4途徑（Shemin pathway）和 C5途徑[6]。 其中 C4途徑是在5-氨基乙酰丙酸合酶 （5-aminolevulinic acid synthase，ALAS）的作用下，催化甘氨酸和琥珀酰-CoA生成ALA，主要存在于光合細菌 （如紫細菌等）、真菌和動物細胞[7-8]。C5途徑存在于植物、藻類及細菌中（如腸桿菌屬等），由谷氨酸經(jīng)過三步酶促反應生成ALA。包括谷氨酰-tRNA合成酶（GluRS，gltX基因編碼）、谷氨酰-tRNA還原酶（GluTR，hemA基因編碼）和谷氨醛氨基轉移酶 （GSA-AM，hemL基因編碼）[9-10]。

目前ALA主要通過化學法合成，但由于化學合成存在諸多問題[6，11]，近年來微生物發(fā)酵生產(chǎn)ALA已成為研究熱點[1]。早期，人們篩選到產(chǎn)ALA的光合細菌類球紅細菌，通過誘變育種篩選高產(chǎn)菌株并經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化，ALA的產(chǎn)量達到27.5 mmol/L[12-15]。但由于光合細菌生長的特殊性，其成本較高，不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。隨著基因工程技術的成熟，Van der Werf等以大腸桿菌為宿主細胞，成功表達了來源于類球紅細菌的ALAS，通過添加前體物質，ALA產(chǎn)量達到22.0 mmol/L[8]。隨后基于C4途徑的全細胞催化生產(chǎn)ALA的研究，從ALA合酶來源、宿主細胞、前體物質添加、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化等方面進行，ALA產(chǎn)量達到56.0 mmol/L[16-20]。Kang等通過分析大腸桿菌C5途徑的調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)途徑的關鍵基因hemA和hemL，實現(xiàn)了以葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)ALA[21]。前期我們通過分析下游血紅素合成途徑的基因，發(fā)現(xiàn)過量表達hemD和hemF基因，利于ALA的進一步積累，在組合優(yōu)化表達hemA，hemL，hemD和 hemL 時，ALA 產(chǎn)量提高了25%[22]。

釀酒酵母屬于單細胞真核微生物，被美國食品藥品監(jiān)管管理委員會認定為GRAS（Generally recognized as safe）生物[23]。釀酒酵母基因組測序已于1996年完成，其遺傳背景和生理特征十分清楚，遺傳操作工具成熟，具有轉錄后加工修飾功能[24]。另外，釀酒酵母生長迅速，可利用底物較廣，培養(yǎng)條件簡單，次級代謝產(chǎn)物簡單，并且有較好的耐酸和耐高滲透的能力，可以進行大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)[25-27]。自1981年Hitzemom等用釀酒酵母成功表達人干擾素以來[28]，在釀酒酵母中已成功表達了多種原核和真核生物來源的蛋白質及代謝產(chǎn)物[29-32]。

ALA在堿性環(huán)境下能自發(fā)可逆二聚化縮合生成2，5-（β-羧乙基）二羥吡嗪，而該物質能進一步不可逆的氧化生成2，5-（β-羧乙基）吡嗪，所以發(fā)酵過程中需維持pH在酸性條件以維持ALA穩(wěn)定，因此改造釀酒酵母合成ALA具有明顯優(yōu)勢。作者選擇釀酒酵母為宿主細胞，以C4和C5途徑為基礎運用代謝工程方法構建釀酒酵母工程菌株，研究真核生物合成ALA的能力，為構建高產(chǎn)ALA的釀酒酵母工程菌提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 大腸桿菌Escherichia coliJM109及釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeINVsc1：由作者所在實驗室保藏；類球紅細菌Rhodobacter spheroides2.4.1：購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。其中E.coli JM109用于質粒構建和保存以及C5途徑基因hemA和hemL的擴增，S.cerevisiaeINVsc1作為宿主細胞并用于擴增編碼ALAS的hem1基因和啟動子 ADH1，R.spheroides2.4.1用于擴增編碼ALAS的hemA基因。本研究所用菌株和質粒分別列于表1和表2中。

1.1.2 主要工具酶和試劑 PrimeSTAR DNA聚合酶、DNA連接酶、感受態(tài)制備試劑盒：購于TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒及片段柱純化試劑盒：購于Thermo Fisher公司；氨芐青霉素、亮氨酸、組氨酸、色氨酸、YNB、質粒提取試劑盒和基因組提取試劑盒：購于上海生工生物有限公司；蛋白胨和酵母粉：購于Oxoid公司；5-氨基乙酰丙酸：購于Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母粉 5.0，NaCl 10；固體培養(yǎng)基添加 2.0 g/dL瓊脂；根據(jù)需要添加終質量濃度100 μg/mL的氨芐青霉素。

YNB選擇培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，硫酸銨5.0，YNB 1.7，pH 5.6～6.0； 固體培養(yǎng)基添加 2.0 g/dL 瓊脂；根據(jù)需要添加終質量濃度為50 μg/mL的亮氨酸、組氨酸、色氨酸。

YPD發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，酵母粉 10，胰蛋白胨20，根據(jù)情況添加甘氨酸1.5，琥珀酸2.0。

表1 本研究所用的菌株Table 1 Strains used in this study

表2 本研究所用的質粒Table 2 Plasmids used in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質粒的構建 本文用于構建質粒所用引物列于表3。

1）質粒pY26-hem1的構建：以S.cerevisiaeINVsc1基因組為模板擴增hem1基因，選擇NotI和BglII限制性酶切位點，將酶切得到的hem1基因片段連接質粒pY26啟動子TEF后，得到質粒pY26-hem1，見圖 1（a）。

2）質粒pY26-hemA的構建：以R.spheroides2.4.1基因組為模板擴增hemA基因，選擇NotI和HpaI限制性酶切位點，將酶切得到的hemA基因片段連接質粒pY26啟動子TEF后，得到質粒pY26-hemA，見圖 1（b）。

3）質粒 pY26-hemA′-hemL的構建：以 E.coli JM109基因組為模板分別擴增hemA和hemL基因，選擇SacII和BglII限制性酶切位點，將酶切得到的hemA基因片段連接質粒pY26啟動子TEF后，得到質粒pY26-hemA′，在此基因上，用SpeI和SmaI兩個限制性酶切位點，將酶切得到的hemL基因片段連接質粒pY26-hemA′啟動子GPD后，得到質粒 pY26-hemA′-hemL，見圖 2。

4） 質粒 pY26-hemA′-hemL-ADH1-hem1 的構建：由于質粒pY26自身酶切位點的限制，以質粒pY26-hemA′為基礎，先連接片段ADH1-hem1，再連接基因hemL。首先以釀酒酵母基因組為模板分別擴增乙醇脫氫酶的啟動子ADH1和編碼ALAS的基因 hem1，以pMD19為載體組裝ADH1-hem1，隨后用EcoRI和XhoI兩個限制性酶切位點構建pY26-hemA′-ADH1-hem1。然后與經(jīng) SpeI和 SmaI酶切得到的hemL片段進行連接，得到質粒pY26-hemA′-hemL-ADH1-hem1，見圖3。所有構建質粒均經(jīng)測序驗證正確。

表3 本文所用的引物Table 3 Primers used for plasmids construction in this study

圖1 編碼ALAS的基因hem1和hemA質粒構建過程圖Fig.1 Schematic of plasmids construction with genes encoded ALAS.pY26-hem1，pY26-hemA

圖2 質粒pY26-hemA′-hemL構建過程圖Fig.2 Schematic of plasmid construction pY26-hemA′-hemL

1.2.2 釀酒酵母轉化及重組菌培養(yǎng)方法 按照Invitrogen公司提供的LiAc/SS-DNA/PEG法制作釀酒酵母感受態(tài)細胞，轉化重組質粒，涂布含所需氨基酸的YNB選擇性平板，獲得的酵母轉化子經(jīng)菌落PCR檢驗。

圖3 共表達C4和C5途徑關鍵基因質粒構建過程圖Fig.3 Schematic of plasmids construction for coexpression of genes in the co-expression C4 and C5 pathway

大腸桿菌培養(yǎng)條件為37℃，220 r/min培養(yǎng)約12 h。

重組釀酒酵母培養(yǎng)方法：挑取驗證正確的酵母轉化子接種于YNB液體培養(yǎng)基中，在28℃、220 r/min條件下培養(yǎng)36 h，按10%接種體積分數(shù)轉接至YPD培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min下培養(yǎng)48 h。

1.2.3 菌體濃度和ALA的測定 菌體濃度測定方法（測定細胞OD值）：用蒸餾水將發(fā)酵液稀釋到合適的倍數(shù)，使用UV-1700分光光度計（Shimadzu，Kyoto，Japan）在600 nm處測定吸光值。

ALA的測定采用比色法[33]。首先將樣品在12 000 r/min離心2 min，將胞外上清液進行適當稀釋后，取稀釋液 300 μL，分別加入 400 μL 的乙酸鈉緩沖液（82 g無水乙酸鈉與57 mL的冰乙酸用水定容至1 L）和35 μL的乙酰丙酮，煮沸反應15 min。冷卻至室溫，加入Modified Ehrlich’s reagent試劑（1.0 g對二甲氨基苯甲醛與8.0 mL的70%的高氯酸用冰乙酸定容至50 mL）反應10 min，然后在554 nm處測定吸光度，根據(jù)ALA/OD554的標準曲線計算ALA的質量濃度。

1.2.4 ALA合酶的酶活力測定 取相同細胞量的發(fā)酵液在4℃、12 000 r/min條件下離心2 min，收集菌體，用50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）洗滌菌體兩次后重懸菌體，在低溫條件下利用玻璃珠對酵母細胞振蕩破碎，4℃、12 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液并測定ALA合酶的酶活力。

ALA合酶的酶活力定義為：37℃下1 min生成1 μmol的ALA所需的酶量為一個酶活力單位（U）。具體測定方法如下[34]：在 1 mL的 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）中，包括 0.1 mol/L 的甘氨酸、0.2 mol/L的琥珀酰-CoA、1.0 mmol/L的磷酸吡哆醛和50μL的樣品。37℃水浴30min后，加入150μL的體積分數(shù)10%三氯乙酸終止反應，12 000 r/min下離心5 min，取上清液測定ALA。

2 結果與討論

2.1 通過C4途徑改造釀酒酵母合成ALA

釀酒酵母自身含有編碼C4途徑關鍵酶ALAS的基因hem1。另外，目前研究較廣泛的是來源于光合細菌類球紅細菌中編碼ALAS的基因hemA[8，35]，為構建生產(chǎn)ALA的釀酒酵母細胞，在S.cerevisiaeINVsc1中分別過量表達自身來源的基因hem1和來源于R.sphaeroides2.4.1的基因hemA，考察ALA的合成情況，結果見圖4。根據(jù)釀酒酵母合成ALA的差異選擇ALAS的基因來源。

圖4 不同條件下重組釀酒酵母合成ALA的情況Fig.4 ALA production of the recombinant S.cerevisiae with precursors or not

從圖4中看出，釀酒酵母自身合成ALA的量很少，表達不同來源的ALAS后，ALA產(chǎn)量均有一定的提高。在添加前體物質甘氨酸和琥珀酸后，ALA的產(chǎn)量明顯提高。其中表達自身來源的hem1基因，ALA產(chǎn)量最高，為327.6 mg/L，高于表達R.sphaeroides2.4.1基因hemA的301.8 mg/L。結合表4中ALAS酶活可以看出，hem1基因編碼的ALAS的活性高于hemA基因編碼的ALAS。文獻報道釀酒酵母和類球紅細菌來源的ALA合酶對底物甘氨酸的Km值分別為3.0 mmol/L和8.33 mmol/L，說明釀酒酵母來源的ALA合酶對底物的親和力比類球紅細菌來源的ALA合酶大[36-37]。所以選擇釀酒酵母來源的hem1基因作為下一步在S.cerevisiae INVsc1中改造C4途徑提高ALA產(chǎn)量的基礎。

表4 不同重組釀酒酵母ALAS酶活Table 4 Activity of ALAS with different recombinants

2.2 通過C5途徑改造釀酒酵母合成ALA

在釀酒酵母細胞中不含有ALA合成的C5途徑，研究發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌C5途徑中，分別由基因hemA和hemL編碼的GluTR和GSA-AM是途徑中的關鍵酶[21]。為了在釀酒酵母中引入C5合成途徑，將來源于大腸桿菌中的基因hemA和hemL在釀酒酵母中表達，分析ALA的合成情況，結果見圖5。

圖5 表達C5途徑關鍵酶對釀酒酵母生長和合成ALA的影響Fig.5 Effect of key enzymes of C5 pathway on cell growth and ALA production in S.cerevisiae

可以看出，表達基因hemA和hemL后，ALA產(chǎn)量有一定的提高，為280.2 mg/L，但低于表達基因hem1時ALA的產(chǎn)量。同時菌體生長受到影響，由于C5合成途徑的關鍵前體物質谷氨酸，它是一種豐富型氮源，當細胞中存在谷氨酸時，釀酒酵母細胞會利用部分谷氨酸，將其轉化為谷氨酰胺參與氮代謝途徑[38]。當表達C5合成途徑的基因時，利用了一部分谷氨酸，使得菌體可利用的谷氨酸減少，一定程度上影響了菌體的生長。

2.3 結合C4和C5途徑改造釀酒酵母合成ALA

目前，僅發(fā)現(xiàn)在Euglena gracilis和Scenedesmus obliquusspp.中同時存在C4和C5途徑[39]。為了進一步提高釀酒酵母合成ALA的能力，在分別改造C4、C5途徑合成ALA的基礎上，將C4和C5兩條途徑結合，在S.cerevisiae INVsc1細胞中共表達編碼C4途徑關鍵酶ALAS的基因hem1和編碼C5途徑中限速酶GluTR和GSA-AM的基因hemA和hemL，分析二者對釀酒酵母細胞生長和ALA合成的影響，結果見圖6。

圖6 共表達C4和C5途徑關鍵酶對釀酒酵母生長和合成ALA的影響Fig.6 Effect of key enzymes of C4 and C5 pathway on cell growth and ALA production in S.cerevisiae

由于C4和C5途徑的代謝流同時指向ALA的生成，因此將這兩條途徑有機地結合在一起，同時培養(yǎng)基中添加了前體物質，琥珀酸在一定程度上影響細胞內(nèi)TCA循環(huán)，使得胞內(nèi)谷氨酸的量提高，更有利于在釀酒酵母細胞中積累ALA，ALA產(chǎn)量為525.8 mg/L。

3 結 語

釀酒酵母作為單細胞真核微生物，具有性質穩(wěn)定、研究徹底、運用廣泛、生長迅速，利于發(fā)酵等特點。近年來，隨著合成生物學技術的發(fā)展，通過設計裝配目的產(chǎn)物合成模塊，打破生物制造的物種界限，各種來源的化合物逐漸在釀酒酵母中實現(xiàn)了生物合成途徑的重構[29，40]。在本研究中，通過代謝工程手段根據(jù)ALA的合成途徑在釀酒酵母里實現(xiàn)了ALA的合成，釀酒酵母作為安全菌株用于合成ALA，一定程度上擴展了ALA的應用價值。但產(chǎn)量仍較低，仍需要在酶分子改造，代謝途徑優(yōu)化及培養(yǎng)條件控制等方面進行系統(tǒng)分析研究以進一步提高釀酒酵母合成ALA。本研究改造釀酒酵母生產(chǎn)ALA對真核生物合成五碳化合物等方面的研究有著積極意義。

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