維吾爾醫(yī)異常黑膽質(zhì)證大鼠模型的尿液代謝組研究

米熱阿依·亞力昆，阿合爾扎馬尼·麥麥提，巴哈古力·阿卜都熱合曼 太力艾提·吐爾洪，迪那拉·恰熱甫汗，阿仙姑·哈斯木，巴吐爾·買買提明

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011； 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011； 3. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011； 4. 新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011)

維吾爾醫(yī)學(xué)以四大物質(zhì)學(xué)說為基礎(chǔ)發(fā)展出了多種理論體系，其中體液論是由四大物質(zhì)和氣質(zhì)論的基礎(chǔ)上發(fā)展的重要學(xué)說之一[1]。體液論認(rèn)為異常黑膽質(zhì)證作為一種證候，在其發(fā)生、發(fā)展過程中受到多種內(nèi)外因素包括飲食(干寒屬性飲食)、環(huán)境(干寒環(huán)境、環(huán)境污染等)、精神因素(焦慮、憤怒、恐慌、憂慮等)的綜合作用下致病性和危險(xiǎn)性逐步增強(qiáng)，最終導(dǎo)致腫瘤、高血壓、哮喘、糖尿病等復(fù)雜性疾病[2]。相對于其他體液質(zhì)而言，異常黑膽質(zhì)的致病性、危險(xiǎn)性及其惡性程度最高。

本研究以異常黑膽質(zhì)證為研究對象，采用傳統(tǒng)的外部特征觀察與代謝組學(xué)研究手段相結(jié)合的方式，分析大鼠外部特征與尿液代謝物成分輪廓的變化特點(diǎn)，闡述異常黑膽質(zhì)證大鼠尿液代謝成分變化程度，尋找與異常黑膽質(zhì)證發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的潛在特異性代謝標(biāo)志物及其變化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雄性SD大鼠14只，4～6周齡，體重(180±20)g，來自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK (新) 2011-0004】，并在此實(shí)驗(yàn)【SYXK(新)2011-0001】。首先進(jìn)行為期3 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)，根據(jù)體重隨機(jī)分為2組，即對照組(n=7)和異常黑膽質(zhì)證模型組(n=7)。實(shí)驗(yàn)程序符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)的相關(guān)規(guī)定，批準(zhǔn)號：IACUC-20140304001。

1.1.2 試劑與儀器

DSS緩沖液(武漢安隆科訊技術(shù)有限公司)，RXZ-436 A氣候箱(寧波江南儀器廠)，體溫計(jì)、電擊籠、代謝籠、5 mm 核磁管(美國Wilmad Lab Glass公司)；超純水 Milli-Q系統(tǒng)(美國Millipore公司)，600 MHz核磁共振波譜儀(美國Varian 公司)。

1.2 方法

1.2.1 異常黑膽質(zhì)證模型的制備

將實(shí)驗(yàn)大鼠置于干寒飼養(yǎng)環(huán)境，相對濕度25%～32.8%，溫度(6±1)℃，用干寒飼料喂養(yǎng)；干寒飼料用等重量的芫荽子和大麥與普通鼠飼料按7∶3比例均勻混合制作。進(jìn)行間斷的足底電刺激：第1周電壓20/25 V，每次25 min，1日/次；第2周電壓30/35 V，每次35 min，1日/次；第3周電壓45/50 V，每次45 min，1日/次；制動(dòng)：第1周1次/日，每次40 min；第2周1次/日，每次60 min；第3周1次/日，每次90 min。上述多因素復(fù)合刺激下飼養(yǎng)21 d，建立異常黑膽質(zhì)證大鼠動(dòng)物模型。

1.2.2 外部特征觀察

由固定實(shí)驗(yàn)人員對大鼠的各項(xiàng)外部特征進(jìn)行觀察，包括毛發(fā)、舌苔、睡眠、糞便、尿量、飲水飲食情況、行為、興奮程度、情緒和體重增長率等，并按照文獻(xiàn)[3]所描述的評分標(biāo)準(zhǔn)在開始建模的第7天、第14天、第21天對大鼠進(jìn)行評分，24分為模型成立的臨界值，超過24分為模型成立。

1.2.3 尿液核磁共振氫譜的檢測

將樣品以12 000 r/min離心10 min，取450 μL上清液至5 mm核磁管中，再加入DSS緩沖溶液50 μL以便進(jìn)行鎖場和定標(biāo)操作。采用NOESYPRESAT-ID (RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ)脈沖序列進(jìn)行氫譜的測定。壓制水的信號采用預(yù)飽和方式、時(shí)間為2 s，圖譜采用32 k的采樣點(diǎn)數(shù)和10 000 Hz譜寬，掃描次數(shù)128次，采樣時(shí)間均為1.64 s，測試溫度為25℃。為了圖譜中代謝物的確認(rèn)，對部分樣本進(jìn)行了核磁共振二維譜檢測，包括質(zhì)子全相關(guān)譜(TOCSY)，1H-1H同核相關(guān)譜(1H-1H COSY)和J-分解譜(J-RES)等。

1.3 圖譜處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對所有核磁共振氫譜進(jìn)行手動(dòng)相位及基線調(diào)整，并用增寬因子為0.5 Hz的指數(shù)窗函數(shù)進(jìn)行處理。DSS作為內(nèi)標(biāo)，其化學(xué)位移定為0 ppm。對每一個(gè)氫譜進(jìn)行分段積分，積分段為0.003 ppm，范圍是0 ～10 ppm，總積分段是3367個(gè)。積分值進(jìn)行歸一化處理，除去水峰信號范圍δH=4.95～4.70 ppm，對數(shù)據(jù)采用SIMCA軟件進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA)。本研究中在對數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析之前通過200次的排列驗(yàn)證試驗(yàn)對PLS 模型進(jìn)行外部驗(yàn)證。多變量分析中的變量相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient，r)是判斷代謝物在兩組中差異性的依據(jù)。r值為正的代謝物在異常黑膽質(zhì)證模型組大鼠尿液中含量比對照組高的代謝物，而r值為負(fù)的代謝物在異常黑膽質(zhì)證模型組大鼠尿液中含量比對照組低的代謝物。差異性代謝物采用Metabo Analyst 3.0進(jìn)行代謝通路分析，確定這些代謝物參與的代謝通路，結(jié)果中通路影響因子(pathway impact)> 0.1和 -log(p) > 3的代謝通路被確定為2組中差異明顯的代謝通路。

2 結(jié)果

2.1 異常黑膽質(zhì)載體模型外部特征的變化

對照組大鼠與異常黑膽質(zhì)證大鼠外表、舌像、糞便及尿液狀態(tài)比較的結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，正常組大鼠的皮膚毛發(fā)有光澤、不毛躁，舌像淡粉色、紅潤，糞便成形、呈黏糊狀，尿液尿量正常、呈淡黃色；而異常黑膽質(zhì)證模型大鼠皮膚毛發(fā)粗糙、無光澤，舌像暗紫、有斑點(diǎn)，糞便成形、干燥且不易排出，尿量較少、棕黃色、有臭味。另外，正常對照組大鼠行為較活潑、睡眠良好、飲水和飲食量正常、對刺激敏感；而異常黑膽質(zhì)證模型大鼠精神呆滯、蜷縮少動(dòng)、易驚、嗜睡、飲水和飲食量減少、對刺激反應(yīng)性遲鈍、易怒、攻擊性強(qiáng)。

注：a、b、c、d為對照組；e、f、g、h為異常黑膽質(zhì)證組。圖1 對照組大鼠與異常黑膽質(zhì)證大鼠外表、舌像、大便及尿液狀態(tài)比較Note. a, b, c and d are of the healthy control groups. e, f, g and h are of the abnormal Savda syndrome groups.Fig.1 Comparison of the external appearance, tongue, stool and urine between the rats of healthy control group and abnormal Savda syndrome group

2.2 異常黑膽質(zhì)證評分結(jié)果

分別在開始建模第7天、第14天、第21天對每個(gè)動(dòng)物進(jìn)行評分，圖2顯示評分變化結(jié)果。根據(jù)結(jié)果顯示，造模第7 天對照組及異常黑膽質(zhì)證載體模型組大鼠的評分 <15分；造模第14天對照組大鼠評分 <15分，而異常黑膽質(zhì)證組大鼠評分值為15～22分；造模第21 天對照組大鼠 <15分，而異常黑膽質(zhì)證組大鼠評分值為25～29分。

圖2 對照組與異常黑膽質(zhì)證組評分值分布圖Fig.2 Score distribution map of the healthy control group and abnormal Savda syndrome group

2.3 體重增長

對照組與異常黑膽質(zhì)證組大鼠體重變化曲線如圖3所示。結(jié)果顯示，隨著模型的建立，兩組的體重差距逐步擴(kuò)大，模型組的大鼠體重增長率明顯低于對照組。

圖3 對照組與異常黑膽質(zhì)證組大鼠體重變化曲線Fig.3 Changes of body weight in the healthy control group and abnormal Savda syndrome group

2.4 尿液代謝物變化

對照組與異常黑膽質(zhì)證組大鼠尿液樣本核磁共振氫譜數(shù)據(jù)采用PLS-DA分析后的得分圖和排列驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。排列驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)參數(shù)分別R2=(0.0, 0.574)，Q2=(0.0, -0.229)，可見PLS模型真實(shí)有效。2組大鼠尿液檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析確定了27種差異性代謝物，結(jié)果見表1。表1中，異常黑膽質(zhì)證組大鼠尿液中含量比對照組高的代謝物r值為正，而含量低的代謝物r值為負(fù)。圖5顯示OPLS-DA分析的相關(guān)系數(shù)圖(s-line plot)，其顏色變化表示代謝物在不同組別之間的差異程度，圖中紅色表示差異性大，藍(lán)色表示差異性小，其方向指向含量高的組。結(jié)果顯示，異常黑膽質(zhì)證組大鼠尿液中共有23種代謝物含量明顯降低，而4種代謝物含量明顯升高；含量降低的代謝物有丙酸酯、乳酸、丙氨酸、丙酮酸、乙酸、乙酰胺、糖蛋白、丙酮、甲胍、肌氨酸、鳥氨酸、甘氨酸、肌酸、肌酸酐、肌胺酸酐、β-半乳糖、尿刊酸酯、酪氨酸、苯丙氨酸、馬尿酸、氨基馬尿酸、甲酸和賴氨酸；含量升高的代謝物有尿素、檸檬酸、尿囊素和α-酮戊二酸等。采用MetaboAnalyst 3.0對這些代謝物參與的代謝通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)共有7種代謝通路發(fā)生了明顯的變化，包括丙酮酸代通路(乳酸、丙酮酸、甲酸和乙酸)，精氨酸/脯氨酸通路(丙酮酸、鳥氨酸、肌酸、肌酸酐和尿素)，苯丙氨酸通路(苯丙氨酸、酪氨酸、馬尿酸、氨基馬尿酸和丙酮酸)，賴氨酸降解通路(賴氨酸和甘氨酸)，甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸通路(甘氨酸、肌酸和丙酮酸)，二羧酸通路(檸檬酸、丙酮酸和甲酸)及三羧酸循環(huán)(丙酮酸和檸檬酸)等，詳見圖6和表2。

注：●為對照組；●為異常黑膽質(zhì)證組。圖4 PLS-DA分析得分圖及排列驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Note. ●, the healthy control group. ●, the abnormal Savda syndrome group.Fig.4 Results of PLS-DA analysis score chart and arrangement verification test

表1 異常黑膽質(zhì)證大鼠與對照組比較尿液中差異性代謝物及其相關(guān)系數(shù)(r)Tab.1 Comparison of the urinary metabolites and their correlation coefficients between abnormal Savda syndrome group and healthy control group

注： s為單峰，d 為雙重峰，t 為三重峰，q 為四重峰，m 為多重峰。

Note. s, single peak. d, double peak. t, triple peak. q, quadruple peak. m, multiple peak.

圖5 OPLS-DA分析相關(guān)系數(shù)圖Fig.5 Graph of OPLS-DA analysis of correlation coefficients

差異性代謝通路Differentialmetabolicpathways影響因子InfluencingfactorsP值Pvalue丙酮酸代謝通路Pyruvatemetabolicpathway0.41960.000精氨酸/脯氨酸代謝通路Arginine/prolinemetabolicpathway0.19800.001苯丙氨酸代謝通路Phenylalaninemetabolicpathway0.15060.001賴氨酸降解通路Lysinedegradationpathway0.21180.009甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路Glycine/Serine/threoninemetabolicpathway0.18850.010二羧酸代謝通路Dicarboxylatemetabolicpathway0.14690.011三羧酸循環(huán)Krebscycle0.15350.015

注：a. 丙酮酸代謝通路；b. 精氨酸/脯氨酸代謝通路；c.苯丙氨酸代謝通路；d. 賴氨酸降解通路；e. 甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路；f. 二羧酸代謝通路；g. 三羧酸循環(huán)。圖6 對照組與異常黑膽質(zhì)證大鼠尿液差異性代謝物相關(guān)的代謝通路Note.a,Pyruvate metabolic pathway.b,Arginine/proline metabolic pathway.c,Phenylalanine metabolic pathway.d,Lysine degradation pathway.e,Glycine/serine/threonine metabolic pathway.f,Dicarboxylate metabolic pathway.g,Krebs cycleFig.6 The differential metabolic pathways between the healthy control group and abnormal Savda syndrome group

3 結(jié)論

本研究結(jié)果證明，異常黑膽質(zhì)導(dǎo)致模型組大鼠尿液代謝物成分明顯變化，這些代謝物主要參與大鼠體內(nèi)的7種代謝通路，包括丙酮酸通路、精氨酸/脯氨酸通路、苯丙氨酸通路、賴氨酸降解通路、甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸通路、二羧酸通路及三羧酸循環(huán)等。

3.1 丙酮酸代謝通路

本研究中發(fā)現(xiàn)的與丙酮酸代謝通路相關(guān)的代謝物有乳酸、丙酮酸、甲酸和乙酸的4種代謝物，其在模型組大鼠尿液中的含量明顯降低。丙酮酸位于能量代謝關(guān)鍵途徑的交叉點(diǎn)，這是糖酵解的最終產(chǎn)物和糖異生的出發(fā)點(diǎn)，并可以通過轉(zhuǎn)氨基作用生成丙氨酸；也可以由丙酮酸脫氫酶復(fù)合物轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A并進(jìn)入三羧酸循環(huán)，也可以作為長鏈脂肪酸和酮體的起始點(diǎn)。體內(nèi)氨的轉(zhuǎn)運(yùn)，降低乳酸含量和加強(qiáng)糖異生等方面丙氨酸也有較強(qiáng)的作用。丙酮酸羧化酶和丙酮酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中與丙酮酸代謝相關(guān)的主要代謝酶，這兩種酶的活性變化可能在異常黑膽質(zhì)證發(fā)生、發(fā)展過程中體內(nèi)能量代謝變化的關(guān)鍵所在。

3.2 精氨酸/脯氨酸代謝通路

是精氨酸、鳥氨酸、脯氨酸、瓜氨酸和谷氨酸共同的代謝通道，其中鳥氨酸處在這個(gè)代謝通道中的關(guān)鍵位置，是瓜氨酸和精氨酸的主要來源，而精氨酸是一種條件必需氨基酸，具有多種作用，包括提供氮源，改善免疫功能，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、分化及合成細(xì)胞因子，維護(hù)腸黏膜完整性等[4]，同時(shí)也是合成肌酸與磷酸肌酸的主要前體。在肝細(xì)胞鳥氨酸主要參與尿素循環(huán)，也參與谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸的生物合成。本研究結(jié)果顯示，異常黑膽質(zhì)證模型大鼠尿液中與精氨酸/脯氨酸代謝通路相關(guān)的多種代謝物含量明顯降低，而尿素含量明顯升高。尿素循環(huán)主要在肝臟中進(jìn)行，是由精氨酸通過精氨酸酶水解后產(chǎn)生，可見，異常黑膽質(zhì)與肝臟尿素循環(huán)相關(guān)，這與維吾爾醫(yī)學(xué)體液論所闡述的“體液發(fā)生于肝臟”[2]這個(gè)論斷有一定的相符性。尿液肌酸酐含量的變化是腎功能的主要指標(biāo)之一[5]，本研究結(jié)果顯示，異常黑膽質(zhì)證的發(fā)生與發(fā)展可能伴隨腎臟功能的異常。

3.3 苯丙氨酸代謝通路

合成細(xì)胞蛋白質(zhì)、變成苯丙酮酸、合成酪氨酸等途徑是苯丙氨酸主要的3條代謝路徑。多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)的主要來源是苯丙氨酸的代謝產(chǎn)物之一的酪氨酸。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，異常黑膽質(zhì)導(dǎo)致神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)異常[6]，這可能與苯丙氨酸代謝同路的異常相關(guān)。苯丙氨酸代謝通路中的馬尿酸的主要來源之一是苯甲酸和甘氨酸，腸道菌群直接分解苯甲酸生成馬尿酸。

3.4 賴氨酸降解通路

賴氨酸主要分布在肝臟，經(jīng)過代謝最終進(jìn)入到脂肪酸代謝通道并參與到彈性蛋白和膠原蛋白的合成，也是體內(nèi)肉堿的主要來源之一，體內(nèi)約25%的肉堿是由賴氨酸和蛋氨酸在肝、腎和腦中合成。肉堿通過運(yùn)送線粒體膜外的脂酰CoA進(jìn)入線粒體內(nèi)而發(fā)揮增加脂肪的動(dòng)員和分解，肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶I是這個(gè)運(yùn)輸過程的關(guān)鍵限速酶?？梢?，異常黑膽質(zhì)證大鼠體內(nèi)賴氨酸含量的降低可能與賴氨酸代謝通路中的肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶I的活性變化相關(guān)。

3.5 甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路

是多種氨基酸的生物合成或降解的主要通道，包括甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸等。通道中的甘氨酸和絲氨酸通過多種通路合成，而甘氨酸得主要來源之一是絲氨酸，催化反應(yīng)的是絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶。絲氨酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)是由絲氨酸脫水酶的作用下進(jìn)行。甘氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其含量的變化可能與異常黑膽質(zhì)導(dǎo)致的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)功能異常相關(guān)。

3.6 二羧酸/三羧酸代謝通路

本研究發(fā)現(xiàn)，二羧酸/三羧酸代謝通路中的丙酮酸和甲酸在異常黑膽質(zhì)證大鼠尿液中的含量明顯降低，證明異常黑膽質(zhì)證與體內(nèi)能量消耗的增加密切相關(guān)。但是，異常黑膽質(zhì)證模型大鼠尿液中與三羧酸循環(huán)密切相關(guān)的檸檬酸和α-酮戊二酸等2種代謝物含量明顯升高。三羧酸循環(huán)中α-酮戊二酸被煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)氧化并釋放ATP變成琥珀酸，同時(shí)NAD+變成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。因此，NAD+/NADH的活性在檸檬酸和α-酮戊二酸的進(jìn)一步氧化過程中起到關(guān)鍵作用。 NAD/NADH水平會在藥物、環(huán)境、化學(xué)物質(zhì)等的作用下降低，從而抑制細(xì)胞生長和分化，誘導(dǎo)自由基產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果顯示，NAD+/NADH活性升高可以明顯延緩衰老、改善線粒體能量代謝水平[7-8]。因此，異常黑膽質(zhì)證發(fā)生、發(fā)展過程中的NAD+/NADH活性變化機(jī)制需進(jìn)一步研究。

此外，異常黑膽質(zhì)證模型大鼠尿液中糖蛋白含量明顯降低。糖蛋白與丙氨酸共同維持免疫功能的正常作用[9]，可見，其含量的下降可能與免疫功能的下降相關(guān)。

研究結(jié)果顯示，模型組大鼠在異常黑膽質(zhì)證發(fā)生、發(fā)展過程中不但發(fā)生外在表形的明顯變化而且也發(fā)生了內(nèi)在多種代謝通路的明顯變化，導(dǎo)致尿液代謝產(chǎn)物的明顯異常。這些代謝產(chǎn)物相關(guān)的代謝通路主要與能量代謝、腸道菌群平衡、肝臟與腎臟功能及免疫功能等有關(guān)，這可能與異常黑膽質(zhì)證的生物學(xué)機(jī)制密切相關(guān)。

參考文獻(xiàn)(References)

[1] 買買提·努爾艾合提，厲蓓，董競成，等. 維吾爾族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)異常黑膽質(zhì)證的研究概況 [J].中國民族醫(yī)藥雜志，2013，19(2)：44-49.

Mammat Nurahmat, Li B, Dong JC. Survey of studies on abnormal Savda syndrome in traditional Uighur medicine [J]. J Med Pharm Chin Minorities, 2013, 19(2):44-49.

[2] 買買提明·沙比爾.維吾爾醫(yī)學(xué)診斷學(xué) [M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出社，1993：135-148.

Maimaitiming Sabir. Diagnostics of Uighur medicine [M]. Urumqi: Xinjiang Science and Technology Publishing House, 1993:135-148.

[3] 巴哈古力·阿卜都熱合曼，阿布力克木·毛拉尤甫，買吾拉尼江·依孜布拉，等. 異常黑膽質(zhì)證2型糖尿病大鼠模型的血漿代謝組學(xué)研究 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2017，27(8)：16-21.

Bahaguli Abudureheman, Abulikemu Maolayoufu, Mawlanjan Hizbilla, et al. Plasma metabonomic study of abnormal Savda rat model with type 2 diabetes[J]. Chin J Comp Med, 2017, 27(8):16-21.

[4] 陳亞軍，齊玉梅.精氨酸免疫營養(yǎng)作用的研究進(jìn)展 [J]. 中國臨床營養(yǎng)雜志, 2007, 15(5): 310-314.

Chen YJ, Qi YM. Research advancement of arginine in immunonutrition [J]. Chin J Clin Nutrition, 2007, 15(5): 310-314.

[5] 馬青山，王茜，趙凱姝，等. UPLC-MS/MS法測定高尿酸血癥大鼠血清及尿液中的尿酸和肌酐 [J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2013，34(12)：2716-2720.

Ma QS, Wang Q, Zhao KS，et al. UPLC-MS /MS method for determination of uric acid and creatinine in serum and urine of hyperuricemic mice [J]. Chem J Chin Univ, 2013, 34(12): 2716-2720.

[6] 黃靜靜，阿衣古麗·玉努斯，努爾比亞· 吾布，等. 異常黑膽質(zhì)證神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫紊亂與趨化因子的關(guān)系 [J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36(5)：567-573.

Huang JJ, Ayiguli Yunusi, Nuerbiya Wubu, et al. The relationship between disorder of neuro-endocrine-immune network in abnormal Savda Hilit and chemokines [J]. J Xinjiang Med Univ, 2013, 36(5): 567-573.

[7] 郭志新，McNeill JH.N-乙酰半胱氨酸對糖尿病大鼠腎臟NADPH 氧化酶表達(dá)的影響 [J]．中國糖尿病雜志，2008，16(9)：544-547．

Guo ZX, McNeill JH. Effect of N-acetylcysteine on the expression of renal NADPH oxidase in streptozotocin-induced diabetic rats [J]. Chin J Diabetes, 2008, 16(9): 544-547．

[8] 洪華，曾進(jìn)勝，王瑩，等．阿托伐他汀對大鼠缺血再灌注腦組織中NADPH 氧化酶源性超氧陰離子的抑制作用 [J]．中國病理生理雜志，2008，24(7)：1345-1350．

Hong H, Zeng JS, Wang Y, et al. Inhibitive action of atorvastatinon NADPH oxidase-derived superoxide anion in ischemic brain tissue after reperfusion in rats [J]. Chin J Pathophysiol, 2008, 24(7):1345-1350．

[9] 陳宜鎮(zhèn)，陳宏. 蛋白質(zhì)與臨床 [M]. 福州：藍(lán)盾出版社. 2004：70-71.

Chen YZ, Chen H. Protein and clinical [M]. Fuzhou: Landun Press. 2004:70-71.