兩個豚鼠品系眼球生物學特性比較及視網(wǎng)膜近視相關機制研究

陳雁虹，衛(wèi)振，艾志鵬，劉迪文

(浙江大學實驗動物中心，杭州 310058)

近視是指眼在不使用調(diào)節(jié)時，平行光線通過眼的屈光系統(tǒng)屈折后，焦點落在視網(wǎng)膜之前的一種屈光狀態(tài)。在亞洲進行的近視流行病學調(diào)查結(jié)果顯示中國人近視率普遍高于白色人種[1]，尤其是中國大陸、中國臺灣、中國香港和新加坡青少年的近視發(fā)病率高于世界其他地區(qū)。針對近視患病率急劇升高的現(xiàn)狀，科學家們已陸續(xù)開展對近視病因和發(fā)病機制的研究。20世紀70年代近視動物模型的建立，為近視研究開辟了一條新的途徑，一些無法在人類身上進行的研究可以通過動物模型來實現(xiàn)。合適的近視動物模型將直接決定實驗研究是否成功和實驗結(jié)果是否準確。

豚鼠因其出生后即開眼，眼球的發(fā)育過程與人類相似，視力優(yōu)于大小鼠，溫順配合好，易獲得測量數(shù)據(jù)等優(yōu)勢，而成為目前最常用于近視疾病模型研究的實驗動物。Zmu-1:DHP豚鼠是浙江大學實驗動物中心經(jīng)過近二十年悉心培育獲得的近交系品系[2]，在該品系豚鼠用于眼科實驗的過程中發(fā)現(xiàn)，該純白色豚鼠品系與DHP豚鼠品系相比，具有易自發(fā)性近視的特點[3-4]。因此，作者選擇將Zmu-1:DHP和DHP兩個豚鼠品系進行眼球相關生物學特性比較，并對視網(wǎng)膜近視相關機制展開研究。

視黃酸(retinoic acid，RA)能夠在視網(wǎng)膜細胞內(nèi)合成，是影響鞏膜發(fā)育、光感受器細胞分化、成熟的重要信使分子[5]，視黃醛脫氫酶(retinal dehydrogenase，RALDH)和醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)是RA合成酶[6]。而酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)、酪氨酸激酶(tyrosine kinases，TK)、誘導型NO合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、神經(jīng)型NO合成酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast cell growth factor，bFGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGFβ)是已知參與調(diào)控近視發(fā)生發(fā)展的視網(wǎng)膜信號因子[7]，通過對這些因子mRNA的表達檢測，研究Zmu-1:DHP易自發(fā)性近視的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

3周齡清潔級Zmu-1:DHP豚鼠327只和DHP豚鼠100只，體重140～180 g，由浙江大學實驗動物中心提供【SCXK(浙)2012-0052】，動物飼養(yǎng)在浙江大學實驗動物中心清潔級屏障【SYXK(浙)2012-0178】。動物實驗方案經(jīng)浙江大學實驗動物福利倫理審查委員會審查通過【ZJU2015-496-04】。

1.1.2 試劑與儀器

動物組織RNA提取和實時熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司；引物由賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成；眼球固定液由浙江大學醫(yī)學院公共技術平臺提供。

紅外偏心攝影驗光儀(eccentric infrared photoretinoscope，EIR)，實驗室自行搭建；角膜曲率計(OM.4，Topcon，Japan)，實驗室改良；A超測定儀(AVISO Echograph Class I-Type Bat，Quantel Medical，Clermont-Ferrand，F(xiàn)rance)；脫水機(ASP300S，Leica，Germany)，切片機(RM2235，Leica，Germany)，攤烤片機(TEC-2500，Hestion)，包埋機(EC350-1，Microm，Germany)；倒置顯微鏡(U-25ND6，Olympus，Japan)；CFX Connect實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad，USA)。

1.2 方法

1.2.1 屈光度、角膜曲率與眼軸長度的測定[8]

豚鼠置于暗室檢測臺上，將待測眼對準驗光儀的光源，調(diào)整豚鼠位置使Purkinje影像位于眼球瞳孔中央，待瞳孔和屈光狀態(tài)穩(wěn)定時，記錄屈光值。每次連續(xù)測量三次，取平均值。

由助手固定豚鼠，操作改良角膜曲率計，使光標清晰并呈正圓形，然后調(diào)整曲率計進行讀數(shù)。每只眼連續(xù)測量3次，記錄水平子午線的角膜曲率度數(shù)，測量時間控制在5 min內(nèi)。豚鼠眼睛滴入一滴0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液(Alcon，Puurs，Belgium)，使用A超探頭測量眼軸長度。

327只Zmu-1:DHP豚鼠和100只DHP豚鼠3周齡時通過屈光度測定，統(tǒng)計自發(fā)性近視發(fā)生率，并從篩選出的295只自發(fā)性近視Zmu-1:DHP豚鼠與100只DHP豚鼠中隨機選取各12只豚鼠分別在4、6、8、10、12周時進行屈光度、角膜曲率與眼軸長度的連續(xù)測定。

1.2.2 視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的觀察

12周時，處死Zmu-1:DHP豚鼠和DHP豚鼠各6只，取出一側(cè)眼球，固定于眼球固定液中，進行常規(guī)病理取材、制片和HE染色，顯微鏡下進行組織結(jié)構(gòu)觀察。

1.2.3 實時PCR檢測視網(wǎng)膜信號因子mRNA的表達

12周時，處死Zmu-1:DHP豚鼠和DHP豚鼠各6只，豚鼠視網(wǎng)膜剝離后，按照說明書提取視網(wǎng)膜總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，在實時PCR專用96孔板中配制標準反應體系，進行SYBR Green I實時熒光定量PCR擴增，95℃孵育3 min，95℃ 10 s，60℃ 32 s，40個循環(huán)，融解曲線分析：95℃ 10 s，65℃ 5 s。各引物序列見表1。用基因相對定量法(2-ΔΔCt)計算目的基因相對表達。

表1 視網(wǎng)膜近視因子的PCR引物Tab.1 PCR primers of the myopia factors in retina

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 兩個豚鼠品系3周齡屈光度比較

3周齡時，327例Zmu-1：DHP豚鼠左、右眼屈光度平均值分別為-4.24和-6.27，以屈光度小于-0.25 D作為近視的標準，近視率達到90.21%，較DHP豚鼠左右眼屈光度平均值3.84和1.78，差異有顯著性(P<0.01)，見表2。

2.2 兩個豚鼠品系4～12周屈光度、角膜曲率與眼軸長度變化比較

4～12周，Zmu-1：DHP豚鼠隨周齡增長，左右眼近視度數(shù)均不斷加深，而DHP豚鼠雙眼均未近視，兩品系間屈光度比較有顯著性差異(P<0.01)。兩個豚鼠品系左右眼的角膜曲率均隨周齡增長而逐漸增大，但Zmu-1:DHP豚鼠較DHP豚鼠增長幅度較小，前者左眼第10、12周，右眼第12周角膜曲率明顯小于后者(P<0.01)。4～12周，Zmu-1:DHP豚鼠眼軸長度從8.4 mm增長至約9.3 mm，DHP豚鼠眼軸長度從8.1 mm增長至約8.8 mm，前者眼軸長度大于后者，差異有顯著性(P<0.01)。見表3。

表2 Zmu-1:DHP和DHP豚鼠3周齡屈光度比較Tab.2 Comparison of refraction between the Zmu-1:DHP and DHP guinea pigs at the age of three

注：L表示左眼，R表示右眼，**表示與DHP比較差異有顯著性(P<0.01)。

Note. Symbol L means the left eye, R means the right eye;**P<0.01, compared with DHP guinea pigs.

表3 Zmu-1:DHP和DHP豚鼠4～12周屈光度、角膜曲率、眼軸長度變化比較Tab.3 Changes of refraction, corneal curvature and axial length at 4-12 weeks of age in the Zmu-1:DHP and DHP guinea =12)

注：L表示左眼，R表示右眼，**表示與DHP比較差異有顯著性(P<0.01)。

Note. Symbol L means the left eye, R means the right eye;**P<0.01, compared with the DHP guinea pigs.

2.3 兩個豚鼠品系視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)比較

顯微鏡觀察結(jié)果見圖1。視網(wǎng)膜分為視神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層、外核層、視桿與視錐層、色素上皮層。由圖可見，兩品系的視網(wǎng)膜分層清晰可見，Zmu-1:DHP豚鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層較厚，外核層較薄，外核層細胞體積小，分布數(shù)目少；DHP豚鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層較薄，而外核層較厚，外核層細胞體積大，分布數(shù)目較多(紅色箭頭示)。Zmu-1:DHP豚鼠色素上皮細胞層未見明顯色素顆粒，而DHP豚鼠色素上皮細胞層內(nèi)分布有大量棕黃色色素顆粒(藍色箭頭示)。同時Zmu-1:DHP豚鼠脈絡膜較DHP豚鼠萎縮變薄(黃色箭頭示)。

2.4 兩個豚鼠品系視網(wǎng)膜信號因子mRNA表達差異

與DHP豚鼠比較，Zmu-1:DHP豚鼠視網(wǎng)膜TH的表達明顯降低(P<0.01)，TK的表達顯著增強(P<0.01)，iNOS、nNOS、bFGF和TGFβ的表達明顯增強(P<0.05)，而RALDH和ALDH雖然表達增強，但差異無顯著性。見圖2。

注：A: Zmu-1:DHP豚鼠;B: DHP豚鼠(1. HE染色，×100； 2. HE染色，×200)。紅色箭頭示視網(wǎng)膜外核層，藍色箭頭示色素上皮細胞層，黃色箭頭示脈絡膜。圖1 Zmu-1:DHP和DHP豚鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)比較Note. A: Zmu-1:DHP guinea pigs; B: DHP guinea pigs (1. HE staining, ×100; 2. HE staining, ×200). The red arrow refers to retinal outer nuclear layer, the blue arrow refers to pigment epithelium, the yellow arrow refers to choroidal.Fig.1 Histologicl structure of the retina of the Zmu-1:DHP and DHP guinea pigs

注：*表示與DHP比較差異有顯著性(P<0.05)，**表示與DHP比較差異有顯著性(P<0.01)。圖2 Zmu-1:DHP和DHP豚鼠視網(wǎng)膜信號因子mRNA的表達差異Note.* P<0.05,** P<0.01, compared with the DHP guinea pigs.Fig.2 Myopia factors mRNA expression in the retina of Zmu-1:DHP and DHP guinea pigs

3 討論

通常，在正常視覺環(huán)境下，大多數(shù)幼年動物的雙眼均朝正視化方向發(fā)展，如普通DHP豚鼠，出生時呈遠視狀態(tài), 隨年齡增長，屈光狀態(tài)逐漸調(diào)整，最終完成正視化過程。但達到正視化并非屈光度數(shù)為零，而是仍有一定的遠視，這可能是豚鼠適應環(huán)境的一種表現(xiàn)。Zmu-1:DHP豚鼠卻正好相反，出生時大部分呈近視狀態(tài)，近視自發(fā)率達到90.21%，之后隨年齡增加，近視不斷加深，不能完成正視化過程。根據(jù)對Zmu-1:DHP豚鼠眼軸長度測量結(jié)果的分析，可以推測，該品系的近視是由于眼球前后徑生長過快引起的軸性近視。光鏡下觀察視網(wǎng)膜組織切片，Zmu-1:DHP豚鼠脈絡膜萎縮變，使得玻璃體腔深度增加，眼軸變長，視網(wǎng)膜成像焦點落后，從而導致近視，為上述推測提供了依據(jù)。人類近視的主要致病原因是遺傳和環(huán)境[9]，其中一種軸性近視即由于眼軸增長，脈絡膜變薄而形成。Zmu-1:DHP豚鼠的自發(fā)性近視與人類的軸性近視極為相似，可以作為實驗動物模型應用于人類近視機制的研究。

在近視的發(fā)生發(fā)展中，已知受到多種近視因子影響，而視網(wǎng)膜作為感知視覺的組織在其中起到了重要的作用。目前較為公認的機制是在視網(wǎng)膜調(diào)控下，鞏膜基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)與其抑制因子組織金屬蛋白酶抑制劑2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2，TIMP-2)二者表達失衡，鞏膜主動重塑，引起眼軸過度延長。

本文通過對兩個豚鼠品系視網(wǎng)膜信號因子RALDH、ALDH、TH、TK、iNOS、nNOS、bFGF、TGFβ的mRNA表達檢測，發(fā)現(xiàn)，Zmu-1:DHP豚鼠RALDH、ALDH表達增強，可能導致視網(wǎng)膜合成RA增加，從而引起MMP-2/TIMP-2表達失衡，促使鞏膜細胞外基質(zhì)重塑；同時TH表達降低，TH是多巴胺(dopamine，DA)的合成酶，DA是黑色素合成的前體，其表達降低使得DA合成減少，含量下降，視網(wǎng)膜黑色素缺乏，導致進入眼內(nèi)的光線增加，散射增多，視網(wǎng)膜成像質(zhì)量下降，從而進一步引起視網(wǎng)膜合成、分泌其它信號因子，如TK、iNOS、nNOS、bFGF、TGFβ，這些信號因子共同作用，使得Zmu-1:DHP豚鼠形成自發(fā)性近視。

綜上所述，Zmu-1:DHP豚鼠可以為眼科學科研工作者研究近視相關病理、生理變化過程及機制提供一個遺傳背景清楚，近視發(fā)病率高，近視狀態(tài)穩(wěn)定的疾病動物模型選擇，其自發(fā)性近視更多機制有待后續(xù)更進一步的研究。

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